към чл. 22 Диагностични процедури за потвърждаване и диференциална диагностика на Нюкасълскаболест по птиците 1. Вземане и обработване на проби а) Проби Клоакални тампон-проби (или феклии) и трахеални тампон-проби от болни птици; фекалии или чревно съдържание, мозъчна тъкан, трахеи, бели дробове, черен дроб, далак и други очевидно засегнати органи от умрели неотдавна птици. б) Обработване на пробите Органите и тъканите, посочени в буква “а”, се смесват, а фекалните проби се третират отделно. Тампоните се поставят в достатъчно количество антибиотична среда, като се осигурява пълното им потапяне в нея. Фекалните проби и органите се хомогенизират (в затворен хомогенизатор или с хаван, пестик и стерилен пясък) в антибиотична среда и се изготвя 10 - 20 % суспензия в средата. Суспензиите се оставят в продължение на около два часа при стайна температура (или за по-дълго време при температура 4°С), като след това се очистват чрез центрофугиране (800 до 1000 g в продължение на 10 мин.). в) Антибиотична среда За фекалните проби се изискват високи концентрации на антибиотици, като типичната смес е 10 000 UI/мл пеницилин, 10 мг/мл стрептомицин, 0,25 мг/мл гентамицин и 5000 UI/мл микостатин във фосфатно буфериран физиологичен разтвор (PBS). Тези нива могат да се намалят до 5 пъти за тъкани и трахеални тампони. За премахване на хламидии може да се добави 50 мг/мл окситетрациклин. Абсолютно задължително е след добавяне на антибиотиците да се проверява стойността на рН и да се коригира до стойности между 7,0 и 7,4. 2. Изолиране на вируса а) Изолиране на вируса в кокоши ембриони Пречистената супернатантна течност се инокулира в количества по 0,1 - 0,2 мл в алантоисната кухина на всяко едно от най-малко 4 кокоши ембриона, които са били инкубирани 8 - 10 дни. Най-добре е тези яйца да са получени от специфично, свободно от патогенни микроорганизми птиче стадо, но когато това е невъзможно, се използват яйца, получени от стадо, което е тествано за липса на антитела срещу вируса на Нюкасълската болест. Инокулираните яйца се държат при температура 37 °С и ежедневно се овоскопират. Яйцата с мъртви или умиращи ембриони, както и всички останали яйца 6 дни след инокулирането се изстудяват при 4 °С и алантоисно/амнионовите течности се тестват за наличие на хемаглутинираща активност. Ако не се установи наличие на хемаглутинация, описаната процедура се повтаря, като за заразяване на ембрионите се използва неразредена алантоисно/амнионова течност. При установяване на хемаглутинация се изключва наличието на бактерии в културата. Ако присъстват бактерии, течностите могат да се прекарат през 450 nm мембранен филтър, да се добавят други антибиотици и да се инокулират в кокоши ембриони по описания начин. 3. Диференциална диагноза Всички положителни резултати, получени от регионалните лаборатории, се изпращат на националната референтна лаборатория по чл. 22 за потвърждаване на резултатите и пълно антигенно и биологично типизиране на вируса. До потвърждаването на резултатите се прилагат всички мерки, насочени към ограничаване на възможността за разпространение на вируса. а) Потвърдителна идентификация (доказване) Националната референтна лаборатория по чл. 22 извършва пълно определяне на всички хемаглутиниращи агенти. Присъствието на вируса на НБП се доказва чрез реакция за задържане на хемаглутинацията чрез моноспецифични птичи антитела. Реакцията е описана в т. 6. Положителна хемаглутинация на алантоисната течност при разреждане 24 или повече, при използване на моноспецифичен антисерум срещу вируса на Нюкасълската болест с титър, за който се знае, че е със стойност най-малко 109, следва да послужи като предварително идентифициране и се изисква налагането на всички контролни мерки за предпазване от разпространение на болестта. Тестовете за доказване на интрацеребрален патогенен индекс по т. 7 се извършват на всички изолати, дали положителен резултат за наличие на вируса на НБП. Патогенен индекс, по-висок от 0,7, показва наличие на щам на вируса, който изисква прилагането на всички контролни мерки за предпазване от разпространение на болестта. Някои моноклонални антитела, специфични за ваксиналните щамове, могат да бъдат използвани при реакция за задържане на хемаглутинацията. Такива антитела се осигуряват от референтната лаборатория на Общността и служат за доказване на ваксиналния щам на вируса на НБП в пробите. Националната референтна лаборатория предава всички хемаглутиниращи агенти на референтната лаборатория на Общността. б) Типизиране на изолатите Хемаглутиниращите агенти, предадени на референтната лаборатория, се подлагат на по-нататъшно антигенно и генетично проучване с цел получаване на по-добра информация относно епизоотологията на псевдочумата по птиците. 4. Бързи тестове за откриване на вируса на Нюкасълска болест при ваксинирани птици За откриване на вируса на НБП при ваксинирани птици може да се използват флуоресцентни тестове за доказване на антитела върху надлъжни разрези от трахеи и пероксидазни тестове за доказване на антитела върху мозъчна тъкан. 5. Откриване на антитела при неваксинирани птици а) Проби Кръвни проби се вземат от всички птици, когато числеността на птичите стада е под 20 глави, и от 20 птици - за по-големите стада (това би дало 99% вероятност за откриване на поне един положителен серум, ако 25 % или по-висок процент от стадото е с положителен резултат, независимо от големината на стадото). Кръвта се оставя да се съсири и след това серумът се отделя за тестване. б) Изследване за наличие на антитела За откриването на антитела срещу вируса може да се използва методът ЕЛАЙЗА (ензимно свързан имуносорбентен анализ). Отделните серумни проби се тестват за способността им да възпират хемаглутиниращата активност на вируса на Нюкасълската болест при условията на стандартната реакция за задържане на хемаглутинацията, описана в т 7. Националната референтна лаборатория на България определя за работно разреждане на вируса да се използват 4 хемоглутинационни единици. При 4 хемоглутинационни единици (ХАЕ) за положителен следва да се приема всеки серум с титър, равен на 24 или по-голям. 6. Реакция хемаглутинация Реагенти 1. Изотоничен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между 7,0 и 7,4. 2. Еритроцити (RBC) - взети и събрани в обща проба от най-малко три свободни от патогенни микроорганизми кокошки (ако няма такива, кръвта се взима от птици, които са били обект на редовно наблюдение и са показали, че са свободни от антитела срещу вируса на Нюкасълската болест) в равен обем разтвор на Алсевер. Преди използването им клетките трикратно се промиват с PBS. За теста се използва 1 % суспензия в PBS. 3. Като стандартен антиген се използва щам на НБП от вида “Ulster 2C”. Процедури 1. Във всяка ямка на микротитърната плака се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са V-образните дъна на ямките). 2. В първата ямка се поставят 0,025 мл вирусна суспензия (т.е. алантоисна течност). 3. След внимателно размесване от първата ямка се прехвърлят по 0,025 мл в следващата, след това от нея - в по-следващата и т. н., при което се получават двукратни разреждания на вируса, като се започва от 1:2 и се достигне до 1:4096. 4. Добавят се още 0,025 мл PBS във всяка ямка; 5. Добавят се по 0,025 мл 1 % разтвор на еритроцити във всяка ямка. 6. Размесват се чрез внимателно потупване и се поставят при 4 °С. 7. Контроли - положителна за аглутинация (две ямки, в които се поставят по 0,025 мл PBS, 0,025 мл неразредена вирусна суспензия и 0,025 мл еритроцити) и отрицателна за хемаглутинация (две ямки, в които се поставят по 0,050 мл PBS и по 0,025 мл еритроцити). 8. Плаките се разчитат след 30 - 40 мин. чрез накланянето им и отчитане наличието или липсата на отвесна черта, получена от стичането на еритроцитите. Ямките без хемаглутинация трябва да изглеждат по същия начин както контролните проби без вирус. 9. Хемаглутинационният титър представлява най-голямото разреждане, при което се предизвиква аглутинация на еритроцитите. Това разреждане се приема за 1 хемаглутинационна единица. 7. Реакция за задържане на хемаглутинацията Реагенти 1. Изотоничен фосфатно буфериран физиологичен разтвор (0,05 М) със стойност на рН между 7,0 и 7,4. 2. Алантоисна течност, съдържаща вируса на НБП, разредена с PBS, така че да съдържа 4 хемаглутинационни единици в единица обем. 3. 1 % суспензия от кокоши еритроцити. 4. Негативен контролен кокоши серум. 5. Позитивен контролен серум. Процедури 1. Във всяка ямка на микротитърната плака се накапват по 0,025 мл PBS (за предпочитане са V-образните дъна на ямките). 2. В първата ямка се поставят 0,025 мл от тествания серум. 3. След внимателно размесване от първата ямка се прехвърлят по 0,025 мл във следващата, след това от нея - в по-следващата и т. н., при което се получават двукратни разреждания на серума, като се започва от 1:2 и се достигне до 1:4096. 4. Добавят се по 0,025 мл разредена алантоисна течност, съдържаща 4 хемаглутинационни единици. 5. Смесват се чрез внимателно потупване и се поставят при 4 °С за най-малко 60 мин. или на стайна температура за най-малко 30 мин. 6. Добавят се по 0,025 мл 1 % суспензия на еритроцити във всяка ямка. 7. Смесват се чрез внимателно потупване и плаката се поставя при 4 °С. 8. Плаките се разчитат след 30 - 40 мин., когато контролните червени кръвни телца са утаени. Чрез накланянето им се отчита наличието или липсата на отвесна черта, получена от стичането на червените кръвни телца по същия начин както контролните проби, съдържащи само еритроцити (0,025 мл) и PBS (0,05 мл). 9. Титърът на задържане на хемаглутинацията представлява най-голямото разреждане на антисерума, предизвикващо пълна инхибиция на 4 хемаглутинационни единици вирус (при всеки тест за задържане на хемаглутинацията се извършва предварително титриране на вирусната суспензия и определяне на 4 ХАЕ). 10. Резултатите се считат за валидни, ако при отрицателния серум се получи титър 23 илипо-малък при 4 хемаглутинационни единици на вируса, а при положителния контролен серум се получи титър с най-много едно разреждане разлика от известния му титър. 8. Определяне на интрацеребрален патогенен индекс 1. Инфекциозна прясна алантоисна течност (хемаглутинационният титър трябва да е по-голям от 24) се разрежда 1:10 в стерилен изотоничен физиологичен разтвор (без антитела). 2. От разредения изолат на вируса се инокулират интрацеребрално по 0,05 мл в 10 еднодневни пилета (40 часа след излюпване). Пилетата трябва да са получени от яйца, получени от специфично, свободно от патогенни микроорганизми птиче стадо. 3. Птиците се наблюдават в продължение на 8 дни на 24-часови интервали. 4. При всяко наблюдение птиците се маркират по следния начин: 0= норма; 1= болни; 2= мъртви. 5. Индексът се пресмята по следния начин: Клинич- Ден след инокулацията ни приз- (брой птици) наци 1 2 3 4 5 6 7 8 об- резул- що тат норма 10 4 0 0 0 0 0 0 14 x 0 =0 болни 0 6 10 4 0 0 0 0 20 x 1 =20 мъртви 0 0 0 6 10 10 10 10 46 x 2 =92 Общо=112 Индексът представлява=112/80=1,4 9. Оценка на способността за формиране на плаки 1. Използват се десетократни разреждания до 10-7 в изотоничен физиологичен разтвор, буфериран с фосфат, за да се получат най-ясни плаки. 2. В петриеви панички се приготвят плътни монослоеве от клетки на кокоши ембриони или подходяща клетъчна линия (Мадин-Дарби говежди бъбреци) в диаметър 5 см. 3. По 0,2 мл от всеки разреден вирусен изолат се добавят към петриевите панички и се оставя да се абсорбира за 30 мин. 4. След трикратно измиване в изотоничен PBS разтвор заразените клетки се покриват със среда, съдържаща 1 % агар, 0,01 мг/мл трипсин (или без трипсин). В посочената среда не се добавя серум. 5. След 72-часова инкубация при 37 °С получените плаки трябва да са с достатъчен размер. Те се визуализират най-добре, когато покривният агар се отстрани и клетъчният монослой се боядиса с кристал виолет (0,5 %) в 25 % етанол. 6. Всички вируси трябва да дадат ясни плаки, когато се инкубират с трипсин в покривния слой. Когато не се добавя трипсин, само вируси, вирулентни за пилета, ще образуват плаки.