към чл. 18 Методи за диагностика (за потвърждаване и диференциална диагноза) на инфлуенца поптиците I. Методи за потвърждаване на диагноза инфлуенца по птиците 1. Вземане на материали за лабораторни изследвания: Вземат се клоакални смивки (или фекалии), трахеални смивки от живи болни птици; черва с чревно съдържание; мозък; трахея, бял дроб; черен дроб; далак; други органи с патологични изменения; цели пресни трупове; трупове на убити с диагностична цел болни птици. 2. Разработване на материалите: Органите и тъканите по т. 1 могат да бъдат сборни, но при всички случаи фекалиите са в отделна проба. Смивките се поставят в среда с антибиотици, осигуряваща пълното им потапяне. Пробите се хомогенизират чрез стриване или в хаван с пестик и стерилен пясък, или чрез хомогенизатор. Изготвя се 10 - 20 % суспензия в антибиотична среда. Суспензията се инкубира за около 2 h при стайна температура или на 4 °С за 12 - 24 h. Грубите съставки в суспензията се отстраняват чрез центрофугиране на 800 - 1000 g за 10 min. 3. Антибиотична среда: В отделните лаборатории се използват различни разтвори на антибиотици. За фекални проби се изисква висока концентрация на антибиотици - най-често 10 000 международни единици пеницилин, 10 mg стрептомицин, 0,25 mg гентамицин и 5000 единици микостатин за 1 ml суспензия във фосфатен буферен разтвор (PBS). Тези нива на антибиотици могат да бъдат намалени 5-кратно за останалите тъкани и трахеални смивки. Хламидиите се обезвреждат чрез добавка на 50 mg/mol окситетрациклин. Киселинността (рН) на средата след прибавяне на антибиотици се коригира до 7,0 - 7,4. 4. Изолиране на вируса: Изолирането на вируса се извършва в осем - десетдневни кокоши ембриона (КЕ), като обработената суспензия (супернатанта) се инокулира алантоисно в обем 0,1 - 0,2 ml/КЕ. За всяка проба се използват минимум 4 КЕ. Предпочитат се КЕ от стада, свободни от патогенна флора (СПФ). При липса на такива се използват КЕ от стада, които не показват наличие на антитела срещу вируса на инфлуенцата. Инокулираните ембриони се инкубират на 37 °С и се овоскопират ежедневно. Умрелите и умиращи КЕ и всички останали живи след 6-ия ден на инкубацията се убиват чрез охлаждане на 4 °С. Аланто-амнионовите течности се изследват за хемаглутинационна активност (ХА). Ако не се установи хемаглутинация, описаната процедура се повтаря, като за инокулум се използва неразредена аланто-амнионова течност от предходния пасаж. При положителна хемаглутинация трябва да се изключи присъствието в културата на хемаглутиниращи бактерии. При наличие на бактерии течността се пропуска през филтърна мембрана с размер на порите 450 nm, след което към нея се добавят антибиотици и с нея се инокулират ембрионите по начин, посочен по-горе. II. Методи, прилагани при диференциална диагноза 1. Предварително лабораторно диференциране: Поради важността на мерките за ограничаване разпространението на вируса на инфлуенцата по птиците (ИП) е необходимо да бъде определена и оборудвана национална референтна лаборатория, в която могат да се идентифицират хемаглутиниращи вирусни изолати на ИП от субтип Н5 или Н7, както и на вируса на нюкасълската болест по птиците. За идентифициране на хемаглутинина се провежда реакция възпиране на хемаглутинацията (РВХА). Използват се събраните хемаглутинационни течности и стандартни положителни и отрицателни серуми съгласно т. 5 и 6. Основанията за налагане на ограничителни мерки на терена са положителните за инфлуенца титри 24 и повече срещу субтиповете Н5 и Н7. Теренните изолати обикновено показват титри 29 и повече. 2. Потвърждаване на предварителната диференциална диагноза: Тъй като досега са идентифицирани 13 субтипа на основата на хемаглутинина (от Н1 до Н15) и 9 субтипа на основата на антиген неураминитоза (от N1 до N9), както и на различни комбинации между тях, не е практично и финансово изгодно националните лаборатории да разполагат с всички субтипове антисеруми, които позволяват да се извърши пълно антигенно характеризиране на изолираните инфлуенчни вируси. 3. Националната референтна лаборатория следва да извърши следното: а) потвърждаване на диагнозата чрез използване на двойно дифузионната реакция преципитация в агаров гел (РПАГ), с която се разкрива общият за всички инфлуенчни вируси групов антиген, описан в т. 9; със същата цел могат да бъдат използвани и тестовете ЕЛАЙЗА и имунофлуоресцентният метод (ИФМ); б) да потвърди или отхвърли, че изолатът е от субтип Н5 и Н7; в) да определи интравенозния патогенен индекс (ИВПИ) в шестседмични пилета съобразно описанието в т. 7; интравенозен патогенен индекс (ИВПИ), по-висок от 1,2, е показател за налагане на ограничителни мерки срещу установения изолат на инфлуенчния вирус; със същата цел може да се използва тестът за плакообразуване в монослойни клетъчни култури (КК) от ембрионални пилешки фибробласти (ЕПФ); г) Националната референтна лаборатория следва незабавно да изпраща до одобрената лаборатория на Европейската общност всички хемаглутиниращи вируси за по-нататъшно антигенно изучаване; в задълженията на одобрената лаборатория на Европейската общност е провеждането на пълно антигенно типизиране, което се извършва за всички получени инфлуенца вируси; за всички Н5 и Н7 субтипове, които не са имали интравенозен патогенен индекс, по-голям от 1.2, е нужно допълнително секвениране на хемаглутининовия ген, за да се определи наличието или отсъствието на повтарящи се аминокиселинни бази на мястото на разцепване на хемаглутиновия протеин. 4. Серологични тестове за разкриване на специфични антитела срещу вируса на инфлуенцата по птиците: а) При провеждане на програми за ерадикация (изкореняване) на огнищата на инфлуенцата, за които хемаглутининовият субтип на вирусния причинител е установен, той може да бъде използван като антиген в РВХА съобразно т. 5 и 6. Със същата цел за антиген може да бъде използван и всеки друг инфлуенчен вирус от същия (хомоложен) субтип. В случаите, когато субтипът на вируса - причинител на инфлуенцата, не е известен, диагнозата може да бъде потвърдена чрез разкриване на специфични антитела в серуми от засегнати птици чрез тестовете за доказване на групово специфичните антигени - РПАГ, ЕЛАЙЗА, ИФМ. При провеждане на ЕЛАЙЗА е възможно да възникне проблем в специфичността й във връзка с гостоприемниковите (като вид птици) имуноглобулинови субстанции. б) Проби. Кръвни проби за лабораторно изследване се вземат от подкрилната вена, както следва: от всички птици на стада до 20 бр.; по 20 проби от по-големите по размер стада (това гарантира откриване поне на една положителна проба с вероятност 99 %; при заразеност на 25 % от птиците в стадата този брой проби е достатъчен за сигурно откриване на инфекцията независимо от големината им). След съсирване (коагулация) на кръвта в пробите серумите се декаптират и съхраняват на 4 °С за изследване до 4 дни. в) Изследване за наличие на специфични антитела. Способността на серумите да инхибират (възпират, задържат) хемаглутинационната активност на инфлуенчните вируси се доказва чрез РВХА в постановки, описани в т. 6. Тя може да се проведе чрез използване на 4 или 8 хемаглутинационни единици (ХАЕ) съобразно желанието на Националната референтна лаборатория. За положителна се счита всяка проба с възпиращ (задържащ) титър 24 и по-голям в тест с 4 ХАЕ и титър 23 и повече в тест с 8 ХАЕ. 5. Реакция хемаглутинация (РХА): Реагенти: а) Фосфатно-буфериран физиологичен разтвор с рН 7,0 - 7,4 (PBS). б) Кръв за изготвяне на еритроцитна суспензия се взема от минимум 3 кокошки, доказано свободни за специфични антитела срещу вируса на инфлуенцата по птиците, за предпочитане от СПФ стадо. Кръвта при вземането се смесва с антикоагулант - равно количество разтвор на Алсевер или 4 % натриев цитрат в съотношение 1:5. Червените кръвни клетки (ЧКК) преди употреба се промиват с РВS 3-кратно в центрофуга при 300 - 500 g. Препоръчва се от промитите ЧКК да се изготви 1 % суспензия в РВS. в) За антиген в РВХА се използва птичи инфлуенчен вирус. Референтната лаборатория към Европейския съюз доставя и препоръчва използване като антигени вируси от субтип Н5 или Н7 с доказана ниска вирулентност. г) Процедури за изпълнение в микровариант: - разлива се PBS във всички ямки на микроплаката с V-образни дъна в обем 0,025 ml; - добавя се 0,025 ml вирусна суспензия (т.е. аланто-амнионова течност от инфектирани КЕ) само в първата ямка от редицата; - с микротитрационна пипета се изготвят 2-кратно нарастващи разреждания на вирусния антиген - от 1:2 до 1:4096; - допълнително се поставя PBS към всяка ямка от редицата в обем 0,025; - добавя се във всяка ямка 1 % суспензия от ЧКК в обем 0,025 ml; - в няколко (2 - 5 бр.) ямки се поставя контролът на еритроцитите без вирус; - следва внимателно разклащане на плаката за размесване на инградиентите и инкубиране при 4 °С; - отчитането на резултатите се извършва след 30 - 40 min, т.е. когато ЧКК в контролните ямки са оформени на дъното във вид на точка; при отчитането плаките се държат в наклонено положение; еритроцитите в контролните ямки и тези с отрицателна хемаглутинация “текат”, а ЧКК в ямките с положителна хемаглутинация оформят нежна пелена на дъното и раменете на ямките, без да “текат”; - хемаглутинационният титър на антигена представлява най-високото му разреждане, което аглутинира напълно ЧКК; това разреждане на вируса съдържа 1 ХАЕ; за по-точно определяне на хемаглутинационния титър се препоръчват и паралелни тест-редици от вирус със стартови разреждания от 1:3 и 1:5; това се прави с оглед на по-прецизно изготвяне на работното разреждане на антигени при използване в РВХА. 6. Реакция възпиране (задръжка, инхибиция) на хемаглутинацията: Компоненти: а) фосфатен буферен физиологичен разтвор (PBS); б) вируссъдържаща аланто-амнионова течност, разтворена с PBS, така че да съдържат 4 или 8 ХАЕ антиген в 0,025 ml (антиген); в) суспензия от птичи ЧКК в 1 % суспензия; г) отрицателен контролен серум; д) положителен контролен серум. Процедури за изпълнение в микровариант: а) разлива се PBS във всяка ямка на микроплаката с V-образни дъна в обем 0,025 ml; б) добавя се 0,025 ml от серума за изследване само в първа ямка от редицата; в) с микротитрационна пипета се изготвят двукратно нарастващи разреждания на серума - от 1:2 до 1:4096; г) добавя се по 0,025 ml от работното разреждане на антигена, съдържащо 4 или 8 ХАЕ/0,025 ml; д) в няколко ямки на отделна редица се поставят по 2 - 5 ямки контроли на ЧКК (без вирус и без серум) и антигенът (без серум); е) следва внимателно разклащане на плаката за размесване на инградиентите и инкубиране на 4 °С за минимум 60 min или на стайна температура (18 - 25 °С) за минимум 30 min; ж) добавя се във всяка ямка от редицата, вкл. в контролите, 1 % еритроцитна суспензия в обем 0,025 ml; з) следва повторно размесване на инградиентите и поставяне на 4 °С; резултатът се отчита след 30 - 40 min или когато ЧКК в контролните ямки за еритроцити са оформени на дъното на ямките във вид на точка; при отчитане плаките се държат в наклонено положение; еритроцитите в ямките за контрол на ЧКК и положителните за специфични антитела серумни разреждания са утаени под формата на точка и “текат”, а в контролните ямки за антигена и отрицателните за антитела серумни разреждания образуват нежна пелена на дъното и раменете на ямките и не “текат”; и) възпиращият титър представлява най-високото разреждане на изследвания серум, което задържа напълно хемаглутинационната активност на антигена в 4 или 8 ХАЕ; препоръчително е да се направи допълнителна проверка, че използваният в теста антиген е в точно изискваното количество (4, респ. 8 ХАЕ); й) резултатът от изследването ще бъде валиден, при условие че титърът на отрицателния контролен серум не надхвърля 23 при използване антиген с 4 ХАЕ или 22 - с 8 ХАЕ, а титърът на положителния контролен серум не се отклонява с повече от едно деление (ямка) в плюс или минус от предварително известния му титър. 7. Интравенозен патогенен индекс: а) Тестът ИВПИ се провежда на 10 пилета на шестседмична възраст, чувствителни към вируса на инфлуенцата по птиците. б) Пилетата се инокулират интравенозно с вируссъдържаща алакто-аруниконова течност от нисък пасаж, от разреждане 10-1 в доза 0,1 ml. За разредител се използва стерилен буфериран физиологичен разтвор (РВS). в) За контрола се използват 10 пилета от същата партида, инокулирани по същия начин, и доза от разредителя, без вирус. г) Опитните и контролните пилета ежедневно се наблюдават в продължение на 10 дни и резултатите се регистрират през 24 h. д) Резултатите от наблюденията се групират по тежест в 4 групи: нормални - без никакви клинични признаци, оценявани с фактор нула; болни - с фактор 1; тежко болни* - с фактор 2, и умрели - с фактор 3. е) От отчетените резултати се изчислява ИВПИ, както е показано в таблицата: Клинични Дни след инокулацията Общо признаци 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 резултат Нормални 10 2 0 0 0 0 0 0 0 0 12 х 0 = 0 Болни 0 4 2 0 0 0 0 0 0 0 6 х 1 = 6 Тежко 0 2 2 2 0 0 0 0 0 0 6 х 2 = 12 болни Умрели 0 2 6 8 10 10 10 10 10 10 76 х 3 = 228 общо: 246 Наблюде- 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 100 ния (бр.) Забележка на редакцията: виж таблицата в PDF-а на броя Общо 246 ИВПИ = ––––––––––––––– = –––––– = 2,46 Наблюдения (бр.) 100 * За тежко болно се счита всяко опитно пиле, което показва повече от един от следните клинични признаци: респираторни усложнения, депресия, диария, цианоза на оголените части от кожата и обиците, оток на главата, нервни признаци. 8. Проучване за плакообразуваща способност: а) От вируссъдържащата аланто-амнионова течност се изготвят в РВS 10-кратни нарастващи разреждания - 10-1 до 10-7. Най-добре е да се използват такива разреждания на вируса, които осигуряват оптимален брой плаки в петрите с възможност за тяхното изброяване. б) Изготвят се първични монослойни КК от ЕПФ или подходяща постоянна клетъчна линия (напр. Madin-Darby bovine kidney) в петриеви панички с размер 5 cm в диаметър. в) От всяко вирусно разреждане се прибавя в две петриеви панички по 0,2 ml инокулум. Петритата се оставят за абсорбция на вируса на стайна температура за 30 min. г) Следва трикратно промиване с РВS на клетъчната повърхност и третираният клетъчен монослой се покрива с 5 ml 1 % w/v разтопен агар, несъдържащ, респ. съдържащ 0,01 mg трипсин за 1 ml среда. Покриващата агарова среда не следва да съдържа никакъв серум. д) Следва инкубация на петритата с култура на 37 °С за 72 h, когато образуваните плаки са достатъчно големи по размер и могат да бъдат изброявани с невъоръжено око. Инкубацията се провежда в среда с 5 % СО2. Плаките се виждат най-добре, когато монослоят бъде оцветен. За целта покриващият слой агарова среда от всяка петра внимателно се отстранява, а останалият прикрепен към дъното клетъчен монослой оцветява с кристал виолет - 0,5 % w/v в 25 % V/V етанол. е) Всички вируси на инфлуенцата по птиците образуват плаки в посочените КК, които съдържат трипсин. Плаки в отсъствие на трипсин образуват само вирулентни за птици вирусни изолати на инфлуенцата. 9. Двойнодифузионен агар-гел преципитационен тест: Имунодифузионният агар-гел преципитационен тест е най-предпочитан за доказване присъствие на нуклеокапсидния (NР) и метричен (М) антиген, които са общи (групови) за всички субтипове на вируса на инфлуенцата по птиците. Това се постига чрез използване като антиген на концентриран вирус или на суспензия от инфектирани хормоалантоисни мембрани (ХАМ). Вируссъдържащите аланто-амниалови течности се центрофугират при висока скорост на въртене, при което вирусните антигени от вътрешността на капсида и на матрикса се освобождават и допълнително третират с натриев lauroyl sacrogine. Със същата цел може да бъде използван и кисел преципитат, т.е. получен чрез третиране на аланто-амнионовите течности с 1 N солна киселина при крайно рН 3,5 - 4,0, охлаждане за 1 h до 0 °С и центрофугиране при ниска скорост - 1000 g за 10 min. Следва отстраняване на супернатантата, а вируссъдържащият преципитат се ресуспендира в минимален обем на glycine-Sarcosyl буфер (1 % Sodium lauroyl sacrosinate буфериран до рН 9,0 с 0,5 М glycine). Така изготвеният препарат съдържа както нуклеокапсидния (NP), така и матриксния (М) антиген. Beard (1970) описва изготвянето на обогатен нуклеокапсиден антиген от ХАМ на инфектирани с вируса на инфлуенцата КЕ. Хориолактопсните мембрани след отпрепариране от инфектираните КЕ се хомогенизират в хаван с пестик или хомогенизатор, след което 3-кратно се замразяват и размразяват. Следва нискооборотно центрофугиране - на 1000 g за 10 min. За антиген в теста се използва супернатантата, инактивирана с 0,1 % формалин. Антигените, изготвени по описаните два метода, могат успешно да бъдат използвани в рутинния двойнодифузионен агар-гел преципитационен тест. Средата за този тест се изготвя от 1 % агароза при агар плюс 8,0 % натриев хлорид в 0,1 М фосфатен буфер, рН 7,2. Тестът се провежда в петри или предметни стъкла, поставени в херметизирана стъклена вана, съдържаща достатъчно влага (напоена с вода филтърна хартия). При положителен резултат ще се наблюдават специфични преципитационни линии между антигена и известния (познат) положителен серум срещу вируса на инфлуенцата по птиците. Резултатът се отчита между 18 и 72 h при наблюдение над светлинен лъч под ъгъл 45°.
Част от този текст е публикувана само като изображение или приложение в „Държавен вестник“, бр. 18 от 2006 г., и не се показва тук. Отворете оригинала