Наредба № 7 от 6 февруари 2004 г. за профилактика и борба с болестта африканска чума по свинете

С тази наредба се определят:

1. 1. мерките срещу проникване, разпространение и за ликвидиране на болестта африканска чума по свинете (АЧС);
2. 2. методите за диагностика на болестта;
3. 3. задълженията на държавните органи, физическите и юридическите лица за прилагане на мерките по т. 1.

Епизоотологичното проучване по чл. 4, ал. 2, т. 1 следва да изясни:

1. 1. произхода на инфекцията;
2. 2. времето и пътя за проникване на вируса в свиневъдния обект;
3. 3. периода на скрито протичане на инфекцията;
4. 4. наличието на други свиневъдни обекти, в които има вероятност от проникване на вируса;
5. 5. придвижване на свине и продукти от тях, трупове на свине, хора и транспортни средства, които биха могли да бъдат преносители на вируса;
6. 6. вероятността вектори, диви свине или заразени с вируса на АЧС продукти да причинят разпространението на болестта.

При лабораторно потвърждаване на АЧС държавният ветеринарен лекар освен мерките по чл. 4 - 6:

1. 1. нарежда: а) всички свине в засегнатия обект незабавно да се умъртвят по начин, гарантиращ неразпространението на вируса на АЧС; б) да се подложат на обработка, осигуряваща унищожаването на вируса на АЧС, всички предмети, материали, отпадъци и фураж, за които съществува вероятност да са контаминирани; в) да се унищожат всички материали за еднократна употреба, които биха могли да са контаминирани, и особено тези, използвани за кланични процедури; г) да се почистят и дезинфекцират по правилата на приложение № 3 сградите и помещенията, в които са пребивавали свинете, транспортните средства и контаминираният с вируса на АЧС околен терен;
2. 2. взима в съответствие с изискванията на диагностичното ръководство достатъчен брой проби от свинете, за да може да се установи начинът на проникване в свиневъдния обект на вируса на АЧС, както и продължителността на предшестващия обявяването на болестта период, през който то вероятно е присъствало в обекта;
3. 3. проследява преработката на месото от свине, заклани през периода между вероятното проникване на болестта в свиневъдния обект и налагането на ограничителните мерки;
4. 4. контролира преброяването и преработването на труповете на умрелите или умъртвените свине;
5. 5. контролира унищожаването на семенния материал, яйцеклетките и ембрионите, събрани в свиневъдния обект през периода между вероятното проникване на болестта и налагането на ограничителните мерки;
6. 6. изпраща взетата от първично огнище на болестта АЧС проба за лабораторно изследване съгласно формулираната в диагностичното ръководство процедура за определяне на генетичната разновидност на вируса;
7. 7. провежда епизоотологично проучване съгласно чл. 5.

При потвърдено наличие на АЧС в свиневъден обект, състоящ се от две или повече отделни производствени единици, с цел да се осигури приключване на угояването на свинете по преценка на директора на съответната РВМС мерките по чл. 8, т. 1, буква “а” могат да не се прилагат върху всички производствени единици, при условие че разполагат с напълно изолирани помещения и съоръжения за настаняване, отглеждане и хранене, гарантиращи невъзможност да се разпространи вирусът на АЧС от една производствена единица в друга.

В съответствие с изискванията на диагностичното ръководство се вземат достатъчен брой проби от свинете, за да може наличието на вирус на AЧС в контактния свиневъден обект официално да се потвърди или отхвърли.

При определяне на зоните по чл. 12 директорът на съответната РВМС се съобразява със:

1. 1. резултатите от епизоотологичното проучване;
2. 2. географското разположение на огнището на болестта и по- конкретно всички естествени или изкуствени граници;
3. 3. разположението и близостта на други животновъдни обекти и кланици;
4. 4. начините на придвижване на свинете и търговията с тях;
5. 5. наличните материални и човешки ресурси, които могат да се използват за контрол на придвижването на свине в границите на зоните;
6. 6. необходимостта от извеждане на подлежащите на умъртвяване свине от свиневъдния обект на произход.

Регионалната ветеринарномедицинска служба в сътрудничество с кмета на общината или кметството информират населението в защитната и надзорната зона за въведените ограничения чрез поставянето на ясно видими знаци и предупредителни табели, чрез средствата за масово осведомяване и по друг подходящ начин.

Когато поради възникване на нови огнища в защитната зона мерките по чл. 15 се прилагат повече от 40 дни, в резултат на което в свиневъден обект, разположен в тази зона, възникват икономически или технологични проблеми или проблеми по хуманно отношение към животните, директорът на съответната РВМС може да разреши при условията на чл. 16, ал. 2 и на основание мотивирано заявление от собственика на свинете тяхното транспортиране до:

1. 1. одобрена от НВМС кланица, разположена в защитната или надзорната зона; а при липса на кланица - свинете се транспортират до най-близката до огнището на болестта кланица;
2. 2. екарисаж или място за загробване, където под контрола на държавен ветеринарен лекар свинете незабавно се умъртвяват, а труповете им се преработват или загробват.

Сроковете по чл. 15, ал. 1, т. 3, буква “б”, чл. 17 и чл. 18, ал. 2 могат да бъдат намалени на 30 дни, при условие че в съответствие с диагностичното ръководство са взети проби и са извършени изследвания, въз основа на които може да се отхвърли наличието на АЧС в свиневъдния обект.

В надзорната зона директорът на съответната РВМС предприема мерките по чл. 15, като тази по ал. 1, т. 3, буква “б” се прилага в срок най-малко 30 дни след приключване на мероприятията по почистване и дезинфекция.

Държавният ветеринарен лекар може да разреши транспортирането на свине от надзорната зона след изтичане на 30- дневния срок по чл. 20, ако са спазени условията и редът на чл. 16.

Когато поради възникване на нови огнища в защитната зона мерките по чл. 15 се прилагат в надзорната зона повече от 40 дни, в резултат на което в свиневъден обект, разположен в тази зона, възникват икономически или технологични проблеми или проблеми по хуманно отношение към животните, директорът на съответната РВМС може да разреши при условията на чл. 16, ал. 2 и на основание мотивирано заявление от собственика на свинете тяхното транспортиране до:

1. 1. одобрена от НВМС кланица, разположена в защитната или надзорната зона; а при липса на кланица - свинете се транспортират до най-близката до огнището на болестта кланица;
2. 2. екарисаж или място за загробване, където под контрола на държавен ветеринарен лекар свинете незабавно се умъртвяват, а труповете им се преработват или загробват.

Сроковете по чл. 20 - 22 и чл. 23, ал. 2 могат да бъдат намалени съответно до 21, 30 и 20 дни, при условие че в съответствие с диагностичното ръководство са взети проби и са извършени изследвания, въз основа на които може да се отхвърли наличието на АЧС в свиневъдния обект.

Собствениците под контрола на държавен ветеринарен лекар зареждат свиневъдния обект със свине не по- рано от 40-ия ден след приключване на дейностите по почистване и дезинфекция при спазване на следните изисквания:

1. 1. първоначално свиневъдният обект се зарежда с възприемчиви животни, които при лабораторното изследване са показали отрицателен резултат за наличие на антитела срещу вируса на АЧС или които произхождат от свиневъдни обекти, които не са били обект на ограничения, свързани с АЧС;
2. 2. възприемчивите животни се настаняват върху цялата територия на свиневъдния обект, като на 45-ия ден след настаняването им се вземат проби за наличие на антитела срещу вируса на АЧС; през този период свинете не трябва да напускат свиневъдния обект;
3. 3. от деня на настаняването им се извършва ежедневен клиничен преглед с измерване на телесната температура, като данните за всяко животно се отразяват в специален дневник;
4. 4. лечение на заболели възприемчиви животни се допуска след поставяне на диагноза, изключваща АЧС;
5. 5. пълното зареждане с новозакупени свине се осъществява, ако в нито едно от възприемчивите животни не се установят антитела срещу вируса на АЧС;
6. 6. новозакупените свине се придружават с ветеринарномедицинско свидетелство, като в срок 3 дни от настаняването им в свиневъдния обект числеността им се декларира пред кмета на общината или кметството, пред лицензирания частнопрактикуващ ветеринарен лекар или в съответната районна ветеринарна лечебница, ако тя обслужва свиневъдния обект;
7. 7. новозакупените свине се карантинират за срок 45 дни.

Свиневъдните обекти, в които са предприети мерките по чл. 8, се зареждат с други видове животни след разрешение от държавния ветеринарен лекар, който взима под внимание риска от запазване на векторите, които могат да доведат до разпространение на болестта АЧС.

В свиневъдния обект, от който произхождат заразените свине, предназначени за клане, се прилагат мерките по чл. 8.

По смисъла на тази наредба:

1. 1. “Африканска чума по свинете” е контагиозна болест по домашни и диви свине, причинявана от вирус, който се причислява към семейство ASF- like вируси.
2. 2. “Свиня” е животно от семейство Suidae, вкл. и дива свиня.
3. 3. “Дива свиня” е свиня, която не се държи или отглежда в свиневъден обект.
4. 4. “Свиневъден обект” е всяко място, където се отглеждат или настаняват свине, с изключение на кланици, транспортни средства и заградени пространства, където се държат или се извършва лов на диви свине; заградените пространства трябва да бъдат с размери и пространства, които не дават възможност да се прилагат мерките по чл. 8. 5. “Свиня, за която има съмнение, че е заразена с вируса на АЧС” е свиня или труп от свиня, показващ клинични признаци и/или патологоанатомични изменения или реакции на лабораторни тестове, извършени в съответствие с диагностичното ръководство, които показват съмнителен резултат за наличие на АЧС. 6. “Огнище на АЧС” е свиневъдният обект, в който е открит един или няколко случая на африканска чума по свинете. 7. “Държавен ветеринарен лекар” е ветеринарен лекар от системата на НВМС. 8. “Преработка” е третиране на високорисков материал, гарантиращо унищожаване на вируса на АЧС с цел недопускане на разпространението му. 9. “Заразен район” е район от територията на страната, в който след потвърждаване на един или повече случаи на АЧС при диви свине са въведени мерки за ликвидиране на болестта в съответствие с чл. 30 - 34. 10. “Контактен свиневъден обект” е обект, в който е могъл да проникне вирусът на АЧС, в резултат от местоположението му, придвижвания на свине, хора или превозни средства или по какъвто и да било друг начин. 11. “Случай на АЧС” или “свиня, заразена с вируса на АЧС” е свиня или труп на свиня, при които официално е потвърдено наличието на клинични признаци и/или патологоанатомични изменения, характерни за АЧС, или болестта е потвърдена въз основа на лабораторни изследвания по приложение № 1. 12. “Умъртвяване” е убиване на свинете по безкръвен начин. 13. “Клане” е причиняване смърт на животните чрез пълно обезкръвяване. 14. “Производствени единици” са производствени сгради, в които се отглеждат свине от едно и също направление - угояване, подрастващи, майки кърмачки, заплождане и бременност. 15. “Район с висока плътност на свине” е територия в радиус 10 км около свиневъден обект, за която съществува съмнение или потвърждаване за наличието на АЧС, с наличие на повече от 800 свине на кв. км. 16. “Вектор” е кърлеж от вида Ornithodorus erraticus. 17. “Първичен случай на АЧС при дивите свине” е случай на АЧС, установен при дивите свине в зона, в която не са въведени мерките по чл. 30 - 34. 18. “Първично огнище” е огнище на заразна болест, което няма епизоотична връзка с друго огнище в същия регион на България или с първично огнище в друг регион на България. 19. “Собственик” е физическо или юридическо лице, което притежава животните или е отговорно за тяхното отглеждане срещу заплащане или безплатно. 20. “Контаминация” е наличието на инфекциозен агент във или върху животни, предмети или материали, чрез които може да се пренесе и да причини заразяване на животни. 22. "Надзорна зона" е зона с радиус 10 км около епизоотичното огнище АЧС, включваща защитната зона и служеща за определяне границите на засегнатия район.

Наредбата се издава на основание чл. 23, ал. 2 от Закона за ветеринарномедицинската дейност и отменя Наредба № 28 за профилактика и борба с африканската чума по свинете (ДВ, бр. 99 от 1999 г. ).

Изпълнението на наредбата се възлага на генералния директор на НМВС.

към чл. 2, ал. 2 Допълнителна информация, която се изпраща на Европейската комисия при потвърждаване на наличието на АЧС 1. При обявяване на първични огнища или случаи в кланици или транспортни средства на АЧС се изпраща следната информация: 1.1. брой на възприемчивите животни в огнището, кланицата или транспортното средство; 1.2. брой на умрелите свине от всяка категория в животновъдния обект, кланицата или транспортното средство; 1.3. за всяка категория - процента на заболеваемост и броя на свинете, при които е потвърдена АЧС; 1.4. брой на умъртвените свине в огнището, в кланицата или транспортното средство; 1.5 брой на преработените трупове; 1.6. при обявяване на огнище - разстоянието до най-близкия свиневъден обект; 1.7. ако заболяването е установено в кланица или транспортно средство, местоположението на животновъдния обект или животновъдния обект на произход на заразените свине или трупове. 2. Информацията по т. 1 по отношение на огнища или случаи на АЧС в животновъден обект, кланица или транспортно средство се изпраща с писмен доклад до Европейската комисия, който съдържа: 2.1. датата, на която свинете в животновъдния обект, в кланицата или транспортното средство са били умъртвени или на която труповете им са били унищожени; 2.2. резултатите от проведеното изследване на пробите, взети при убиване на свинете; 2.3. при прилагане на чл. 9 - броя на умъртвените и унищожени свине, както и броя на свинете, които ще бъдат заклани по- късно в рамките на посочения за клането им срок; 2.4. информация, свързана с вероятния произход, или в случай че е доказан, с действителния произход на болестта; 2.5. информация за системата за контрол, която е въведена с цел осигуряване на ефективно прилагане на мерките за контрол върху придвижването на животните, посочени в чл. 15 и 20; 2.6. при първично огнище или случай на АЧС в кланица или транспортно средство, генетична разновидност на вируса, причинил огнището или случая на АЧС; 2.7. при умъртвяване на свине в контактен животновъден обект или в животновъден обект, в който е имало свине, съмнително болни от АЧС, информация за: а) датата на умъртвяване и броя на свинете от всяка категория, които са били умъртвени във всеки един животновъден обект; б) епизоотологичната връзка между огнището или случая на АЧС и всеки един от контактните животновъдни обекти или друга причина за възникване на съмнение за АЧС за всеки животновъден обект поотделно; в) резултатите от лабораторните изследвания на проби, взети от свинете в животновъдния обект и по време на умъртвяването на свине; 2.8. когато свинете в животновъдния обект не са били умъртвени, е необходимо да се предостави информация относно причините за това решение.

към чл. 4, ал. 2, т. 2 Диагностично ръководство I. Описание на причинителя и на заболяването Заболяването Африканска чума по свинете /АЧС/ се причинява от вирус, който се причислява към т. нар. семейство на ASF- like вирусите. Вирусът на АЧС предизвиква разнообразни синдроми, вариращи от перакутно до хронично заболяване, а така също и перзистенция у външно здрави вирусоносители. По- силно вирулентните щамове предизвикват перакутна или акутна хеморагична инфекция, характеризираща се с висока температура, загуба на апетит, хеморагии по кожата и вътрешните органи и смърт след 2 до 10 дни. Смъртността може да достигне до 100 %. Щамовете с по- ниска вирулентност причиняват “меки” клинични признаци - слабо повишаване на телесната температура, намален апетит и депресия, които могат лесно да се сбъркат с тези при други заболявания по свинете и да не доведат до подозрение за заболяването АЧС. Авирулентните, нехемадсорбиращи щамове на вируса предизвикват субклинична нехеморагична инфекция и сероконверсия, но някои животни могат да развият скрити лезии по белите дробове или по кожата в областите над костите и в други зони, податливи на травми. Африканската чума по свинете не може да бъде диференцирана от класическата чума по свинете само чрез клинично и постмортално обследване. Двете заболявания трябва да се имат предвид при диференциална диагноза на всеки акутен фебрилен хеморагичен синдром при прасетата, какъвто се наблюдава например при бактериални септицемии. Лабораторните изследвания са основни при разграничаване на заболяванията. II. Изисквания за биобезопасност на Националната лаборатория за африканска чума по свинете 1. Оценка на риска Вирусът на АЧС не представлява риск за човешкото здраве. Правилата за биобезопасност предотвратяват разпространението на инфекциозен вирус от лабораторията към възприемчивата популация от свине. Вирусът спада към ОIЕ “Група 3”: предизвиква заболяване, което е обект на контрол от органите на НВМС и има огромен риск за разпръскване от лабораторията. 2. Общи принципи на работната среда Изискват се обособени помещения за различните процедури, както следва:

1. 1. разположено задължително в АЧС звеното помещение за аутопсии и постмортални обследвания, оборудвано с филтър, възможности за къпане и преобличане на персонала и двупроходен автоклав за унищожаване на високорисков биологичен материал;
2. 2. биообезопасена лаборатория за работа с диагностични проби и процедури с жив вирус (задължително ниво III на биобезопасност);
3. 3. филтър с душове и съблекалня, базирана на входа/изхода на биообезопасената лаборатория;
4. 4. помещение за хладилници и фризери;
5. 5. помещение за микроскопиране, включително затъмнена част за работа с флуоресцентен микроскоп; 6 . “чиста” стая за подготовка на клетъчни култури, среди и посуда; 7. лаборатория за серологични изследвания с използване на инактивиран антиген; 8. помещение за персонала. 3. Лабораторно облекло При работа с биологичен материал, трупове, диагностични проби от терена, кръв и опитно заразяване на лабораторни животни се използват: работно облекло за еднократна употреба, покриващо плътно всички части на тялото, ръкавици, шапки, очила и маски. Работното облекло, стъкларията и инвентарът подлежат на унищожаване след приключване на манипулациите. При работа с инактивиран антиген се допуска използването само в серологичната лаборатория на работно облекло, което се пере, суши и глади в лабораторията. Стерилизацията на стъкларията и инвентара се извършва също само в лабораторията. 4. Контрол на персонала В лабораторията за диагностика на АЧС се допускат през мокър филтър поименно само лица от персонала, придобили съответната квалификация и инструктирани срещу подпис за работа с особено опасен вирус. На персонала не се разрешава да има достъп до прасета 48 часа след напускане на лабораторията. 5. Оборудване 1. ламинарен бокс (клас III) с двойна НЕРА филтрация; 2. фризер (минус 70 °С); 3. фризер (минус 20 °С); 4. хладилници (минус 4 °С); 5. тъканен хомогенизатор;
6. 6. инкубатор;
7. 7. криостатен микротом;
8. 8. флуоресцентен микроскоп;
9. 9. светлинен микроскоп;
10. 10. охлаждаща центрофуга;
11. 11. ултрацентрофуга;
12. 12. бидестилатор;
13. 13. двупроходен автоклав;
14. 14. перална машина със сушилня и ютия;
15. 15. общо лабораторно оборудване: везни, рН метър, миксер, водна баня, многоканални и едноканални пипети с обем от 10 ?l до 1000 ?l и съответни еднократни наконечници, еднократна посуда за рутинни вирусологични изследвания и поддържане на клетъчни култури, хранителни среди и реактиви;
16. 16. ELISA система: инкубатор, миещо устройство, рийдер за спектрофотометрично отчитане на плаки, компютър със съответен софтуер и принтер;
17. 17. PCR оборудване. 6. Вирусни щамове Всички изолати на вируса на АЧС се съхраняват дълбоко замразени в заключен фризер, който не се използва за съхраняване на други вируси и материали, несвързани с диагностиката на АЧС. Използват се индивидуални ампули, щателно номерирани, с етикет. Води се стриктна конфиденциална документация за вирусните щамове: произход, дати и резултати от контролните изследвания в лабораторията, както и резултатите от генетичното типизиране на Референтната лаборатория на Европейския съюз. 7. Опитни животни Използването на опитни животни не се препоръчва. В случай на крайна необходимост с изричното писмено разрешение на генералния директор на НВМС се допуска провеждането на биологичен опит в биообезопасено звено в рамките на лабораторията за АЧС при строги мерки за сигурност, денонощна охрана и с участието само на персонала на лабораторията. Всички опитни животни се унищожават в рамките на звеното след приключване на опита, труповете се обезвреждат и изгарят. 1. Доказване на вируса 1.1. Проби и подготовка на пробите за изследване. За провеждане на реакция хемадсорбция и инокулация на прасета от тъканите се изготвя суспензия чрез нарязване на малки парченца и стриване в хаван или с помощта на тъканен хомогенизатор. След това се добавя 5 - 10 ml буфериран солеви разтвор или среда за клетъчни култури, съдържащи антибиотици. Суспензиите се пречистват чрез центрофугиране при 1000 g за 5 min. За постановка на реакция хемадсорбция и за инокулация на прасета се използва супернатантата. 1.2. Реакция хемадсорбция (HT). Тестът е основен и определящ за АЧС поради факта, че свинските еритроцити адхезират по повърхността на свински моноцити или макрофаги, заразени с вируса на АЧС, като повечето изолати на този вирус предизвикват феномена хемадсорбция. Изолирани са много малко нехемадсорбиращи вируси, повечето от които са авирулентни, но някои могат да причинят типична акутна форма на болестта. Реакцията се провежда чрез заразяване на първични левкоцитни култури с кръв или тъканни суспензии от съмнително болни прасета (процедура 1) или чрез изготвяне на левкоцитни култури от кръв на заразени в лабораторията прасета или такава от съмнително болни прасета на терена (процедура 2). От 100 ml събрана дефибринирана или хепаринизирана кръв могат да се приготвят до 300 култури. Основно правило е всички процедури да се извършат по начин, предпазващ от контаминиране на културите. Процедура 1. HT в първични левкоцитни култури Прясна кръв от прасе се обработва с хепарин (100 IU/ml кръв), центрофугира се при 700 g за 30 min, левкоцитите се изваждат, промиват се със среда, ресуспендират се до концентрация от 107 клетки/ml в среда за клетъчни култури, съдържаща 10 - 30 % свински серум и антибиотици. За избягване на неспецифична хемадсорбция средата трябва да съдържа серум или плазма от същото прасе, от което са добити левкоцитите. Клетъчната суспензия се разлива в епруветки 160 ? 16 mm в равно количество от 1,5 ml, които се инкубират в положение 5 - 10 °С към хоризонталата при 37 °С. Достатъчно чувствителни към вируса за рутинна диагностика са културите на възраст от 2 до 4 дни. Три от епруветките се заразяват чрез добавяне на 0,2 ml за епруветка от приготвените тъканни проби, като е препоръчително заразяване да се извърши и с десетократни и стократни разреждания на пробите - от особена важност, когато теренният материал е доставен при лоши условия. Залагат се положителни и отрицателни контроли чрез заразяване съответно с хемадсорбиращ вирус и без заразяване за разкриване на възможна неспецифична хемадсорбция. След 3 дни във всяка една от епруветките се добавя по 0,2 ml прясно приготвена 1 %- на суспензия от еритроцити в буферен разтвор. В продължение на следващите 7 - 10 дни културите се наблюдават ежедневно под микроскоп за наличие на цитопатичен ефект (ЦПЕ) и на хемадсорбция. Процедура 2. HT в левкоцитни култури от периферна кръв на заразени прасета Процедурата е по- лесна от подготовката и инокулацията на първични свински левкоцитни култури и дава по- бързи резултати при положителни случаи. Тя може да се изпълни в лаборатории, които не са оборудвани за рутинна вирусологична диагностика: минимални изисквания са наличието на предметни и покривни стъкла, микроскоп, стерилна среда, епруветки и пипети. Кръвта, взета от подозрителни прасета на терена и от такива, инокулирани в лабораторията, се обработва с хепарин и левкоцитните култури се събират за директно наблюдение за хемадсорбция. Вземат се 20 ml от цяла кръв в спринцовка, съдържаща 2000 IU хепарин в 2 ml буферен разтвор, размесват се и се прехвърлят в стъклена епруветка. Епруветката се поставя вертикално в инкубатор или във водна баня при 37 °С и се изчаква утаяването на клетките. Седиментацията се подобрява чрез добавяне на 2 ml разтвор на Декстран 150 в 0,9 % натриев хлорид. Културите се инкубират за 6 - 8 часа при 37 °С, след което малки количества от супернатантата, съдържаща бели кръвни клетки, заедно с еритроцити се наблюдават под микроскоп върху предметно стъкло за наличие на хемадсорбция. 1.3. Доказване на антиген на вируса на АЧС чрез директен имунофлуоресцентен метод (DIF). DIF се използва за доказване на антиген на АЧС в тъкани от подозрителни прасета от терена или на такива, заразени в лабораторията. Допълнително методът може да се използва за доказване на същия в левкоцитни култури, в които не се е наблюдавала хемадсорбция, като по този начин се идентифицират нехемадсорбиращите щамове на вируса. Чрез DIF се разграничава също цитопатичният ефект, предизвикан от вируса на АЧС и от други вируси, например вируса на болестта на Ауески или от този вследствие заразяване с цитотоксичен инокулум. Процедура Изготвят се криостатни срезове, отпечатъчни препарати от изследваните тъкани или от клетъчния седимент от заразени левкоцитни култури върху предметни стъкла, изсушават се на въздух и се фиксират с ацетон за 10 min при стайна температура. Обработват се с флуоресцеин изотиоцианат (FITC)- конюгиран анти- вирус АЧС имуноглобулин в работно разреждане за 1 h при 37 °С във влажна камера. Едновременно с това се фиксират и обработват с конюгат положителни и отрицателни препарати. След промиване с фосфатно- буферен разтвор и обработка на препаратите с глицеринов буфер същите се наблюдават под ултравиолетов светлинен микроскоп. Отчитане на резултатите: Положителни за присъствие на АЧС вирусен антиген са проби, в които се наблюдава специфична грануларна цитоплазматична флуоресценция в паракортикалните тъкани на лимфоидните органи или във фиксираните макрофаги в другите органи. 1.4. Доказване наличието на вирусна нуклеинова киселина чрез полимеразно- верижна реакция (PCR). Чрез PCR- техниката се доказват и идентифицират широк кръг от изолати, принадлежащи към всички известни генотипове на вируса, включително нехемадсорбиращи вируси и изолати с ниска вирулентност. Реакцията е подходяща за идентификация на вирусната ДНК в загнили тъкани, които не са подходящи за вирусна изолация и доказване на антиген. Изследванията за генетично типизиране на вируса чрез PCR се извършват в Референтната лаборатория за АЧС на Европейския съюз, Валдеомос, Мадрид, Испания. 1.5. Биологична проба (инокулация на прасета). Използва се за разграничаване на АЧС от класическата чума по свинете (КЧС), които имат неразличими клинични и патологоанатомични признаци. Заразяват се две групи прасета, животните в едната от които са били ваксинирани срещу КЧС, а в другата са неваксинирани. След заразяване в случай на АЧС умират прасетата и от двете групи, а в случай на КЧС - само тези от групата с неваксинирани животни. 2. Доказване на антитела срещу вируса на АЧС 2.1. Ензим- свързан имуносорбентен метод (ELISA). Методът е директен и с него може да се доказва наличието на антитела срещу вируса на АЧС у прасета, които са били инфектирани с ниско или средно вирулентни вирусни щамове на АЧС. Приготвяне на антиген Антигенът се приготвя от заразени с вируса на АЧС клетки, в растежната среда на които присъства свински серум. За целта с адаптиран вирус се заразява стабилна линия от маймунски клетки, след което същите се инкубират в среда, съдържаща 2 % свински серум, за период от 36 - 48 часа, докато цитопатичният ефект е екстензивен. Промиват се с фосфатно- буферен разтвор, седиментират се при 650 g за 5 min, клетъчният пелет се промива в 0,34 М захароза в 5 mM Tris- HCl, рН 8,0 и се центрофугира за пелетиране на клетките. При температура, по- ниска от 0°С, утайката с клетки се ресуспендира в 67 mM захароза в 5 mM Tris-HCl, рН 8,0; след 10 min се добавя детергент без йони до крайна концентрация от 1 %;изчаква се 10 min до лизиране на клетките, добавя се захароза до крайна концентрация от 64 % в 0,4 М Tris-HCl, рН 8,0 и се центрофугира при 1000 g за 10 min.Супернатантата се събира, добавя се EDTA (2 mM крайна концентрация), бета-меркаптоетанол (50 mM крайна концентрация) и NaCl (0,5 М крайна концентрация) в 0,25 mM Tris- HCl, рН 8,0. Инкубира се за 15 min при 25 °С. Центрофугира се при 100 000 g за 1 час при 4 °С върху подложка от 20 % захароза в 50 mM Tris-HCl, рН 8,0. Антигенът се съхранява при минус 20 °С Процедура ELISA плаката се натоварва с антиген чрез накапване във всяка ямка по 100 ?l от работно разреждане на антигена в 0,05 М карбонатно- бикарбонатен буфер с рН 9,6. Плаката се инкубира при 4 °С за 16 часа (една нощ), след което се промива петкратно с 0,05 % Tween 20 в PBS, рН 7,2. Изследваните серуми, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1:30 в 0,05 Tween 20 в PBS, рН 7,2 и се накапват по 100 ?l от всеки серум двойно в ямките на натоварената плака. В различни части на плаката се накапват четири двойки от всеки положителен и отрицателен серум. Инкубира се при 37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с 0,05 % Tween 20 в PBS , рН 7,2. Във всяка ямка се накапва по 100 ?l конюгат протеин- А/пероксидаза в 0,05 % Tween 20 в PBS, инкубира се при 37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с 0,05 % Tween 20 в PBS. Във всяка ямка се накапва по 100 xl субстрат (10µ?l водороден прекис в 25 ml 0,04 % ортофенилендиамин във фосфатно- цитратен буфер, рН 5,0), инкубира се на стайна температура около 10 min, като след промяната на цвета реакцията се стопира чрез добавяне на 100 ?l 3 N сярна киселина. Отчитане на резултатите Резултатите се отчитат чрез спектрофотометрично изследване при 492 nm на ELISA ридер. За положителен се счита всеки серум, който има абсорбатно ниво, по- високо от двойното средно абсорбатно ниво на контролните отрицателни серуми на плаката. 2.2. Индиректен имунофлуоресцентен метод (IDIF). Методът се използва като потвърдителен за кръвни серуми от зони, свободни от АЧС, които са били положителни в ELISA, и за серуми от ендемични зони, показали съмнителен резултат при ELISA. Приготвя се суспензия от заразени с вируса на АЧС клетъчни култури от свински бъбрек или клетъчна линия от маймунски клетки в концентрация 5 x 105 клетки/ ml, малки капки се наслояват върху предметни стъкла, изсушават се на въздуха и се фиксират с ацетон при стайна температура за 10 min. Съхраняват се при минус 20 °С. Изследваните серуми се загряват при 56 °С за 30 min. След разреждане в буферен солеви разтвор същите заедно с положителни и отрицателни контролни серуми се накапват върху препаратите от заразени и незаразени клетъчни култури, инкубират се за 1 h при 37 °С във влажна камера, след което се промиват с PBS и с дестилирана вода. Върху всички препарати се накапва анти- свински имуноглобулин- FITC конюгат или протеин А- FITC конюгат в работно разреждане, след което същите се инкубират за 1 h при 37 °С във влажна камера. Препаратите се промиват с PBS и с дестилирана вода, накапват се с PBS (глицеролов буфер) и се наблюдават под ултравиолетов светлинен микроскоп. След установяване на положителен резултат от положителния контролен серум върху заразени клетъчни култури и отрицателен резултат при всички останали контролни препарати тестът може да бъде отчетен. Серумите са положителни, когато заразените клетъчни култури показват специфична флуоресценция. Като потвърдителни тестове в някои диагностични лаборатории могат да се използват методите имуноблотинг и имуноелектро-осмоза.

към чл. 8, т. 1, буква “г” Дезинфекция при африканска чума по свинете Принципи и процедури при почистване, дезинфекция и третиране с инсектицидни препарати 1. Общи принципи и процедури: 1.1. дейностите по почистването и дезинфекцията, а когато е необходимо и мерките за унищожаване на гризачи и насекоми посредством официално разрешени препарати, се извършват под ветеринарен контрол и в съответствие с инструкциите на държавен ветеринарен лекар; 1.2. използваните дезинфектанти и концентрациите, в които те се прилагат, трябва да бъдат официално одобрени от държавния ветеринарен лекар, за да се гарантира унищожаване на вируса на АЧС; 1.3. ефикасността на дезинфектантите се проверява редовно, тъй като ефикасността на някои дезинфектанти намалява при продължително съхранение; 1.4. при избор на дезинфектанти, инсектицидни препарати и процедури за дезинфекция и дезинсекция се вземат под внимание видът на сградата, транспортните средства и обектите, които ще бъдат третирани; 1.5. употребата на екстрахиращи мазнините вещества, дезинфектанти и инсектицидни препарати се извършва при условия, гарантиращи запазване на тяхната ефикасност; посочените от производителя параметри, като налягане, минимална температура и време на приложение, трябва да бъдат стриктно спазвани; 1.6. независимо от вида на използвания дезинфектант се прилагат следните общи правила: а) подовете на боксовете, постелите и фекалиите обилно се накисват с дезинфектант; б) щателно механично почистване на помещенията и помощния инвентар, за да се запази ефектът от дезинфекцията, последвани от: в) допълнителна дезинфекция за минималното време на приложение, определено в препоръките на производителя; г) отпадните води след почистването да бъдат зауствани по начин, недопускащ разпространение на АЧС съгласно инструкциите на държавния ветеринарен лекар; 1.7. когато измиването става с течности под налягане, трябва да се избегне повторно замърсяване на вече измитите части; 1.8. измиване, дезинфекция или унищожаване на оборудване, инсталации, предмети или боксове също трябва да бъдат включени; 1.9. след дезинфекцията трябва да се избегне повторно замърсяване; 1.10. почистването, дезинфекцията и дезинсекцията, които се извършват съгласно изискванията на тази наредба, се документират в животновъдния обект или дневника на транспортното средство, а в случаите когато се изисква официално одобрение, се удостоверяват от държавен ветеринарен лекар, контролиращ животновъдния обект. 2. Специални изисквания при почистване и дезинфекция на заразени животновъдни обекти: 2.1. предварително почистване и дезинфекция: а) при умъртвяване на животни се вземат всички необходими мерки да се избегне или сведе до минимум разпространението на вируса на АЧС. Тези мерки включват и инсталиране на временно дезинфекционно оборудване, снабдяване със защитно облекло, душове, обеззаразяване на използваното оборудване, инструменти и съоръжения и прекъсване захранването на вентилационната система; б) труповете на убитите животни се напръскват с дезинфектант; в) ако труповете трябва да се извозят от животновъдния обект за преработка, това става в покрити и непропускащи течности контейнери; г) след извозването на труповете на животните за преработка обектът, където са били настанени животните, и останалите сгради, дворове и др., които са били заразени при умъртвяването или следкланичния преглед, се напръскват с дезинфектант; д) тъканите и кръвта, разлята по време на клането, внимателно се събират и преработват заедно с труповете; е) дезинфектантът се оставя да действа в продължение най-малко на 24 h; 2.2. заключително почистване и дезинфекциране: а) торът или използваните постели се изнасят и третират съгласно т. 3. 1; б) мазните петна и замърсители се отстраняват от всички повърхности чрез използване на екстрахиращи мазнините препарати и повърхностите се измиват с вода; в) след измиване със студена вода повърхностите се напръскват с дезинфектант; г) след 7 дни помещенията се третират с екстрахиращи мазнините вещества, изплакват се с вода, напръскват се с дезинфектант и отново се изплакват с вода. 3. Дезинфекция на контаминирани постели, тор и торова течност: 3.1. торът и използваната постеля трябва да бъдат събрани накуп, за да се повиши температурата им , след което се напръскват с дезинфектант и се оставят най-малко 42 дни или се унищожават чрез изгаряне или заравяне; 3.2. торовата течност се съхранява в продължение най-малко на 60 дни след добавянето на заразените материали, освен ако компетентните власти не разрешат намаляване на периода на съхранение за торова течност, която е била подложена на ефективно третиране в съответствие с инструкциите на официалния ветеринарен лекар, гарантиращо унищожаване на вируса на АЧС. 4. Като изключение от т. 1 и 2 при пасищно отглеждане на свине държавният ветеринарен лекар може да предприеме специална процедура за почистване и дезинфекция, като вземе под внимание вида на животновъдния обект и климатичните условия.

към чл. 34, ал. 1 Указания за улов на вектори 1. Търсенето на вектори се извършва в помещенията за настаняване и почивка на свинете, както и на терена около тях. Обикновено векторите се срещат в стари сгради, на сянка, където температурните условия и влажността са благоприятни. Най-добри резултати при търсенето се постигат през късната пролет, през лятото и ранната есен, периоди, през които векторната активност е най-голяма. 2. Методи за търсене на вектори: a) търсене на вектори в почвата, пясъка или прахта, взета от процепите между камъните (при площи с каменна настилка) или от пукнатините и процепите в стените, под плочките или от подовете на помещенията с помощта на четка или друг подходящ инструмент; пръстта и пясъкът се пресяват; при търсене на млади ларви може да се използва увеличително стъкло (лупа); б) търсене на вектори с помощта на капани с въглероден диоксид; капаните се поставят за няколко часа в боксовете на свинете, за предпочитане през нощта и на сянка, далеч от дневна светлина; капаните трябва да бъдат така конструирани, че векторите да бъдат привлечени възможно най-близо до източника на въглероден диоксид и да не могат да се върнат обратно в естествената си среда.