към чл. 23, ал. 2 (Предишно Приложение № 3 към чл. 22, ал. 2 - ДВ, бр. 79 от 2006 г., в сила от 29.09.2006 г.) Диагностика на болестта африканска чума по конете Реактивите за извършване на описаните методи могат да бъдат получени от референтните лаборатории за АЧК от Европейската общност или референтните лаборатории на Световната организация за здравеопазване на животните. Идентификация на вируса За идентификацията на вируса на африканската чума по конете се използват следните лабораторни техники и методи - ЕЛАЙЗА за бързо доказване на вируса, използвайки поликлонални (ПКА) и моноклонални (МКА) антитела, полимеразно верижна реакция (PCR) и инокулиране на клетъчни култури и новородени мишлета. Винаги трябва да се правят всички тестове при съмнение за АЧК, като се започне от бързите ЕЛАЙЗА или PCR. Изолирането на вирус върху клетъчни култури и последвалото извършване на вирусно неутрализационна реакция (ВНР) с оглед серотипизирането на щама е необходимо да бъде направено от самото начало на появата на болестта. Най-често в лабораториите се прилага реакция ЕЛАЙЗА за поставяне на бърза диагноза. От изключителна важност при поставянето на диагноза АЧК е правилното вземане и транспортиране на пробите до лабораторията. Проби за изолиране на вируса Стабилизирана кръв с антикоагулант, взета по време на температурния стадий на болестта от болните животни, малки парченца (2 - 4 г) от далак, бял дроб и лимфни възли от умрели животни. Пробите се съхраняват и транспортират при 4°С. 1. Клетъчни култури За изолиране на вируса на АЧК успешно се използват постоянна клетъчна линия от бъбрек на хамстер (BHK 21) и постоянна клетъчна линия от миши бъбрек (VERO). Кръвните проби с хепарин се използват за инокулиране неразредени, като след 60 мин адсорбция клетките се промиват и се добавя поддържаща среда. При заразяването на клетъчните линии с органни суспензии от далак, бял дроб и лимфен възел те трябва да бъдат 10%-ни (обем/обем), приготвени с фосфатен буфер (PBS) или клетъчно културална среда, съдържаща антибиотици. При наличие на вирус се появява цитопатичен ефект на клетъчни култури (ЦПЕ) от два до осем дни след заразяването. Задължително се извършват три слепи пасажа преди поставянето на отрицателна диагноза. 2. Новородени мишлета За изолиране на вируса се използва и интрацеребрално заразяване на 1 - 3-дневни новородени мишлета най-малко от две семейства. При положителна реакция при животните се установяват нервни признаци между 3-тия и 15-ия ден след инокулацията. Мозъкът от всичките мишлета (по семейства) се събира, хомогенизира и инокулира повторно на нови най-малко шест новородени мишлета. При този втори пасаж нервните признаци трябва да се появят по-рано (от 2-рия до 5-ия ден) при 100% заразяемост. 3. Сандвич ЕЛАЙЗА Най-малко две реакции ЕЛАЙЗА са разработени за доказване на вирусен антиген от теренни проби или лабораторно заразени клетъчни култури. Едната техника използва поликлонални антитела (ПКА), а другата - моноклонални (МКА), на един и същ основен протеин, който е общ за повечето серотипове на заболяването - VP7. Двата метода могат да се прилагат независимо един от друг, като чрез тях бързо (от 2 до 4 часа) се поставя диагноза АЧК. Реагентите за тези реакции се получават в случай на нужда от Референтната лаборатория за АЧК в Европейския съюз. 3.1. Извършване на ЕЛАЙЗА теста при използването на моноклонално антитяло 3.1.1. Твърда фаза - плаките се натоварват със смес от МКА 5G5 и 3D2, разтворени в PBS съответно 10 µl/ml всяко с последвала инкубация една нощ на 4°С. 3.1.2. След трикратно промиване на плаките с дестилирана вода, съдържаща 0,05% Tween 20, те внимателно се изтръскват върху адсорбиращ материал до отстраняване на излишната течност в ямките. 3.1.3. Накапва се по 200 µl на ямка блокиращ разтвор, съдържащ PBS + 1% говежди серумен албумин (БСА), за един час на 37°С. 3.1.4. Изсипва се внимателно блокиращият разтвор и се изтръскват плаките. 3.1.5. Пробите за изследване (далачни суспензии или клетъчнокултурална течност) се накапват в неразредено състояние, последвано от две разреждания в PBS + 1% БСА по 100 µl на ямка, с последвала инкубация от 1 час на 37°С. Суспензията от органи (далак, бял дроб, л. възел) се получава, като 2 см (около 1 г) от органа се хомогенизират в 3 мл MEM (Minimal essential medium) среда, с последвало центрофугиране на 600 g за 10 мин, като се използва супернатантът. 3.1.6. Плаките се промиват трикратно. 3.1.7. Във всяка ямка се накапва конюгат - по 100 µl биотин-макрирано 5G5 МКА, в разреждане 1:500 в PBS + 1% БСА. След инкубиране за един час на 37 °С плаките се промиват и се накапва по 100 µl на ямка авидин-пероксидаза в оптимално разреждане в PBS + 1% БСА, с последвал престой 45 мин на стайна температура. 3.1.8. Плаките се промиват трикратно и в тях се накапва по 200 µl на ямка субстратен разтвор 10 мл 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone) + 5 µl H2O2. Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 µl разтвор на 3N H2SO4 за около 5 - 10 мин, преди отрицателната контрола да започне да се оцветява. 3.1.9. Плаките се отчитат на ридър при 600 или 620 nm. 3.2. Интерпретиране на резултатите 3.2.1. Първо се изчислява пределната стойност, както следва - С + 0,06 (където С е стойността на отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отклонение, получено при група от 30 отрицателни серума). 3.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от тази, се смятат за отрицателни. 3.2.3. При по-големи стойности от пределната стойност + 0,15 се считат за положителни. 3.2.4. Пробите, показали лъжливо положителни резултати, се подлагат отново на изследване за потвърждаване на резултатите. 4. Полимеразно верижна реакция PCR тестът е специфичен за доказване на вирусния РНК на АЧК. Праймерите кореспондират с 5' края (нуклеотиди 1 - 21) и в 3' края (нуклеотиди 1160 - 1179) от сегмент 8 от РНК на вируса. Извършване на теста От далачна суспензия се екстрахира нуклеиновата киселина, както следва: 1 г от пробата се хомогенизира в 1 мл от денатуриращ разтвор (4 М guanidium thiocyanate, 25 mM sodium citrate, 0,1 M 2-mercaptoethanol, 0,5 % sarcosyl), след което се извършва центрофугиране. Към супернатанта се прибавят 1 g чиста РНК, 0,1 ml of 2 M sodium acetate pH4, 1 ml phenol and 0,2 ml chloroform/isoamyl alcohol mixture (49/1), като получената смес внимателно се разбърква в продължение на 15 мин в баня от лед. Следва отделяне на преципитираната РНК на вируса след фенолна екстракция и преципитация с алкохол. Методът на ДНК синтезата и PCR амплификацията се прилага при 37°C. Секвенциите на PCR праймерите използват последователност 5' GTTAAAATTCGGTTAGGATG 3', която винаги кореспондира с поляритета на добавената РНК. Анализът на получения резултат чрез PCR се извършва посредством електрофореза с 1,2% агаразен гел, съдържащ ethidium bromide. 5. Серологични тестове Индиректният вариант на ЕЛАЙЗА, използващ разтворим вирус на АЧК или рекомбиниран VP7 протеин за доказване на антитела, се прилага доста често. Имуноблотинг тестът също е адаптиран за доказване на антитела срещу вируса на АЧК. Напоследък приложение намери и ЕЛАЙЗА, използваща неструктурния протеин NS3 за антиген, като тази реакция може да служи при разграничаването на ваксинирани от инфектирани животни. РСК се прилага повсеместно, но при някои серуми не се наблюдава антикомплементарна активност. 5.1. Сравнителна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на африканската чума по конете Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказване на антитела срещу вируса на АЧК в серуми от различни видове и категории еднокопитни. Принципът на реакцията се състои в компететивно свързване на антитела срещу вируса на АЧК. Така реакцията, която протича между антигена и антителата от антиморскосвински серум, се променя при добавяне на серумна проба с наличие на антитела срещу вируса, което визуално се отразява в промяна на оцветяването след прибавяне на ензим. Изследваните серуми могат да бъдат тестирани при единично разреждане 1:5 или да бъдат титрирани за установяване на крайното разреждане. Стойности, по-високи от 50%, могат да се считат за положителни. Този метод се използва в регионалната референтна лаборатория за АЧК в Пърбрайт, Великобритания. Извършване на теста 5.1.1. Подготовка на плаките 5.1.1.1. Плаките за ЕЛАЙЗА се натоварват с 100 µl на ямка антиген на вируса АЧК, екстрахиран от клетъчно културална течност и разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, за една нощ при 4°С. 5.1.1.2. Плаките се промиват трикратно с PBS с рН 7,2 - 7,4, след което се подсушават. 5.1.2. Контролни ямки на плаките 5.1.2.1. Положителните контролни серуми се титрират в двойна серия разреждане, започващи от 1:5 до 1:640, в колона 1 в блокиращ буфер (PBS + 5% обезмаслено сухо мляко Cadbury's Marvel TM + 0,05% w/v Tween 20 и 1% ГСА) до получаване на 50 µl на ямка. 5.1.2.2. Към ямки А и В от колона 2 се добавя 50 µl от отрицателния серум при разреждане 1:5 (10 µl серум + 40 µl блокиращ буфер). 5.1.2.3. В ямки С и D от колона 2 (празна) се добавя 100 µl на ямка блокиращ буфер. 5.1.2.4. В ямки E, F, G и H от колона 2 се накапва 50 µl блокиращ буфер. 5.1.3. Метод за единична титрация: Прибавя се в разреждане 1:5 серум в блокиращ буфер в колоните от 3 до 12 (10 µl серуми + 40 µl блокиращ буфер). Или: 5.1.4. Метод на титрацията: Приготвят се двойни серийни разреждания от 1:5 до 1:640 в блокиращ буфер в осем ямки от единични колони (3 до 12). След което: 5.1.5. Добавят се 50 µl антисерум от морско свинче, предварително разреден в блокиращ буфер във всички ямки на плаката с изключение на празните (така навсякъде количеството е 100 µl на ямка). 5.1.5.1. Плаките се инкубират за 1 час при 37°С върху орбитален шейкър. 5.1.5.2. Плаките се промиват трикратно, след което се подсушават. 5.1.5.3. Към всяка ямка се прибавя 50 µl конюгат: заешки антиморскосвински пероксидаза, предварително разтворен в блокиращ буфер. 5.1.5.4. Инкубира се в продължение на 1 час при 37°С върху орбитален шейкър. 5.1.5.5. Плаките се промиват трикратно и се подсушават. 5.1.6. Хромоген Ортофенилендиаминовият разтвор се приготвя според инструкциите (0,4 мг/мл в стерилна дестилирана вода) непосредствено преди употреба. Добавя се субстрат водороден прекис до крайна концентрация 0,05% v/v (1 към 2000 на 30% разтвор на Н2О2). Във всяка ямка се накапва по 50 µl от Орто фенилен диамин разтвора, като след 10-минутен престой на стайна температура реакцията се спира чрез прибавяне на ямка 50 µl 1М H2SO4. 5.1.7. Отчитане Извършва се на ЕЛАЙЗА ридър при дължина на вълната 492 nm. 5.1.8. Интерпретиране на резултатите 5.1.8.1. С помощта на софтуерна програма се отчитат резултатите от оптичната плътност. За валидиране на теста е необходимо горната граница и долната контролна граница на серума от морско свинче да са между 1,4 и 0,4. Крайният титър за положителния контролен серум, базиран на 50%, трябва да бъде 1:240 в граници от 1:120 до 1:480. Всяка плака, която не отговаря на стандарта, трябва да се изхвърли. Въпреки това, ако при отрицателните серуми титърът е 1:480 и нагоре, те могат да се приемат за отрицателни. Двойните серумни ямки на отрицателната контрола и празните трябва да дават стойности съответно между +25% и -25% и между +95% и +105%. При положение че стойностите са извън тези граници, това не означава, че плаката е невалидна, а е признак за оцветяване. 5.1.8.2. Проби, даващи инхибиция повече от 50%, се считат за положителни. Проби, при отчитането на които стойностите са под 50%, се считат за отрицателни. При двойните проби, при които се установяват стойности от различните кладенчета под и над 50%, се считат за съмнителни. Обикновено тези проби се подлагат на повторно изследване. Положителните проби също могат да се титрират с цел да се установи степента на положителност. Метод за единична титрация 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +контр. Тест серуми A 1:5 - контр. B 1:10 - контр. C 1:20 Празен D 1:40 Празен E 1:80 MC кон. F 1:160 MC кон. G 1:320 MC кон. H 1:640 MC кон. - контр. = отрицателна контрола + контр. = положителна контрола MC контр. = контрола "морскосвински" серум Метод на титрация 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +контр. Тест серуми A 1:5 - 1:5 1:5 контр. B 1:10 - 1:10 1:10 контр. C 1:20 Празен 1:20 1:20 D 1:40 Празен 1:40 1:40 E 1:80 MC 1:80 1:80 кон. F 1:160 MC 1:160 1:160 кон. G 1:320 MC 1:320 1:320 кон. H 1:640 MC 1:640 1:640 кон. - контр. = отрицателна контрола + контр. = положителна контрола MC контр. = контрола "морскосвински" серум 5.2. Индиректна ЕЛАЙЗА за доказване на антитела Тестът използва VP7 протеина като антиген за установяване на антитела срещу вируса на АЧК 5.2.1. Процедура на теста: 5.2.1.1. Твърда фаза 5.2.1.1.1. Плаките се натоварват с рекомбиниран АЧКВ 4 VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, след което се инкубират една нощ на 4°С. 5.2.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с дестилирана вода, съдържаща 0,01 % Tween20. 5.2.1.1.3. Накапва се по 200 µl на ямка блокиращ разтвор, съдържащ PBS + 5% обезмаслено сухо мляко "Нестле", с престой 1 час на 37°С. 5.2.1.1.4. Внимателно се излива блокиращият разтвор и плаките се подсушават. 5.2.1.2. Серумни проби: 5.2.1.2.1. Серумите заедно с положителния и отрицателния серум се разреждат 1:25 в разтвор, съдържащ PBS + 5% обезмаслено сухо мляко "Нестле" + 0,05% Tween 20, и се накапват в количество по 100 µl на ямка с последвала инкубация от 1 час на 37°С. При титрирането се прави двойна серия разреждания в цяла колонка, като същото важи и за положителния и отрицателния серум. 5.2.1.2.2. Плаките се промиват, както е описано в т. 2. 5.2.1.3. Конюгат 5.2.1.3.1. Антиконски глобулин, маркиран с пероксидаза, разреден в разтвор, съдържащ PBS + 5% обезмаслено сухо мляко "Нестле" + 0,05% Tween 20 с рН 7,21, се поставя по 100 µl във всяка ямка, с последвала инкубация 1 час на 37°С. 5.2.1.3.2. Плаките се промиват, както е описано в т. 2. 5.2.1.4. Хромоген/субстрат Във всяка ямка се поставя по 200 µl на ямка субстратен разтвор (10 мл 80,6 mM DMAB (dimethyl aminobenzaldehyde) + 10 мл fj 1,56 mM MBTH (3-methyl-2-benzo-thiazolinone hydrazone) + 5 µl H2O2). Цветната реакция се спира чрез прибавяне на 50 µl разтвор на 3N H2SO4 за около 5 - 10 мин, преди отрицателната контрола да започне да се оцветява. 5.2.1.5. Плаките се отчитат на ридър при дължина на вълната 600 или 620 nm. 5.2.2. Интерпретиране на резултатите 5.2.2.1. Първо се изчислява cut-off стойността, както следва - С + 0,06 (където С е стойността на отрицателната контрола, 0,6 е стандартното отклонение, получено при група от 30 отрицателни серума). 5.2.2.2. Пробите, показали стойност, по-ниска от тази, се смятат за отрицателни. 5.2.2.3. При по-големи стойности от cut-off + 0,15 се считат за положителни. 5.2.2.4. Пробите, показали лъжливо положителни резултати, се подлагат отново на изследване за потвърждаване на резултатите. 5.3. Блокираща ЕЛАЙЗА за доказване на антитела срещу вируса на АЧК Чрез метода се доказват специфични антитела срещу вируса на АЧК в серуми от възприемчиви към болестта животни. Основен антиген на реакцията е VP7 протеинът, който е основен за всичките девет серотипа. Този метод се извършва в референтната лаборатория по АЧК на Европейската общност в Алхете, Испания. 5.3.1. ЕЛАЙЗА тест 5.3.1.1. ЕЛАЙЗА плаки 5.3.1.1.1. Плаките се натоварват с новополучен АЧКВ VP7, разреден в карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6, с последвала инкубация за една нощ при 4 °С. 5.3.1.1.2. Плаките се промиват петкратно с PBS, съдържащ 0,05% v/vTween 20 (PBST). 5.3.1.1.3. Плаката се стабилизира със стабилизиращ разтвор, което позволява тя да престоява продължително време на 4°С. 5.3.1.2. Контроли със серумни проби 5.3.1.2.1. Скрининг тест серумите и контролите се разреждат в PBST1:10 директно върху плаката до получаване на краен обем 100 µl на ямка, с последвала инкубация от 1 час при 37°С. 5.3.1.2.2. Титрация: приготвя се двойна серия разреждане на тестираните серуми и положителните контроли (100 µl на ямка от 1:10 до 1:280). Отрицателните контроли се разреждат 1:10. 5.3.1.3. Конюгат Добавя се по 50 µl на ямка предварително разреден моноклонално антитяло срещу VP7, маркирано с пероксидаза, като след хомогенизиране и разбъркване престоява 30 мин при 37°С. 5.3.1.4. Плаките се промиват петкратно с PBST и се подсушават. 5.3.1.5. Хромоген/субстрат Прибавят се по 100 µl на ямка хромоген/субстратен разтвор (1 мл ABTS(2,2'-Azino-bis-[3-етилбензотиазолин-6-sulphuric acid]) 5 mg/ml + 9 ml субстратен разтвор (0,1 M фосфатно-цитратен буфер с рН 4, съдържащ 0,03% H2O2) и се инкубира в продължение на 10 мин на стайна температура. Оцветяването се спира чрез прибавяне на 100 µl на ямка 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate). 5.3.1.6. Отчитане Извършва се посредством ЕЛАЙЗА ридър при дължина на вълната 405 nm. 5.3.2. Интерпретиране на резултатите. 5.3.2.1. Валидност на теста Той е валиден, когато оптичната плътност на отрицателната контрола (ОК) е по-висока от 1,0, а тази на положителната контрола (ПК) е по-ниска от 0,2. 5.3.2.2. Изчисляване на пределните стойности: положителна стойност (ПК) - ОК - (ОК - ПК) x 0,3; отрицателна стойност (ОК) - ОК - (ОК - ПК) x 0,2, където ОК е екстинцията на отр. контрола, а ПК - на положителната. 5.3.2.3. Интерпретиране на резултатите Проби с екстинция, по-ниска от положителната стойност, се считат за положителни за антитела срещу АЧКВ. Проби с екстинция, по-висока от отрицателната стойност, се считат за отрицателни за антитела срещу АЧКВ. Проби с екстинция между тези две стойности се считат за съмнителни, като две до три седмици след това се вземат нови кръвни проби от същите животни и се подлагат отново на изследване с теста. 5.4. Имуноблотинг тест Свързването на антитела с вирусни протеини, разделени при електрофореза и след това прехвърлени върху нитроцелулозна мембрана, също се прилага като метод за доказване на антитела срещу вируса на АЧК. 5.4.1. Тест процедура Полупречистените протеини от вируса на АЧК се разделят с помощта на SDS-PAGE (sodium dodecyl sulphate-polyacrylamide gel electrophoresis) в 15% acrylamide-N,N'-diallytartar-diamide (DATD) гел. Така разделените протеини се прехвърлят върху нитроцелулозни мембранни филтри при постоянен ток със сила 280 mA за 6 часа при 4°С. Нитроцелулозните мембрани се изрязват и се обработват с тестираните серуми в разреждане 1:20, след това с конюгат, маркиран с пероксидаза заешки антиконски имуноглобулин - 1:500, и се инкубира за 1 час на 37°С. Оцветяването на бендовете се извършва посредством 4-хлор-нафтол техника. 5.4.2. Интерпретиране на резултатите Сравняват се бендовете на положителната и отрицателната контрола с тези на изследваните серуми. Появата на повече от два бенда показва, че серумът е положителен за наличие на антитела срещу вируса на АЧК. 5.5. ЕЛАЙЗА срещу неструктурните протеини на вируса (NS3 ЕЛАЙЗА) Тази реакция се използва, за да може да се различават антитела,получени вследствие на ваксинация с AHSV-4, и такива, които са инфектирани с вирулентен вирус. 5.6. Реакция за свързване на комплемента (РСК) РСК се използва с оглед установяването на групово специфични антикомплементални антитела срещу вируса на АЧК. Най-често като антиген се използва захарно-ацетонов екстракт от миши мозък. При отсъствие на стандартизин серум антигенът се титрира срещу местен положителен серум. За контролен антиген служи миши мозък, получен по същия начин от здрави мишки. Серумите от коне трябва да бъдат инактивирани на 56°С, серумите от зебри на 60°С, а от магарета на 62°С за 30 мин. Тестираните серуми се разреждат 1:10 и се инактивират по посочения начин. Титрацията на положителните контроли се извършва в двукратни разреждания. Антигените - положителен и контролен, се разреждат в буфер, съдържащ 4 - 8 антигенни единици във veronal buffered saline, съдържащ 1% gelatin (VBSG); морскосвинският комплемент се разрежда във VBSG до 4 CH50 (50% complement haemolytic units). Серумите, комплементът и антигенът се свързват, поставени в 96-ямкови плаки с равно дъно или в епруветки, поставени на 4°C за 18 часа. Хемолизинът се разрежда в реакцията до 2 хемолитични единици и се употребява заедно с промити овчи еритроцити. Еритроцитите се стандартизират до 3% концентрация и се добавят в ямките. Реакцията продължава с инкубация за 30 мин на 37°C. Плаките се центрофугират на 200 g и се отчита наличието на хемолиза. За контроли служат: (а) серум и комплемент (b) серум и еритроцити (c) антиген и контролен, всеки с 4 CH50, 2 CH50, and 1 CH50 от комплемента (d) антиген с еритроцити (e) контролен антиген с еритроцити (f) разреждания на комплемента от 4 CH50, 2 CH50, and 1 CH5 и (g) еритроцити. Титърът се определя от най-високото разреждане на серум, фиксирано от комплемента с положителния антиген. Така титър в разреждане от 1/10 се счита за положителен, а под 1/10 - за отрицателен. 5.7. Реакция вирус неутрализация (ВНР) ВНР се използва се определяне на серотипа. Вирусният антиген се разрежда до 30 - 100 TCID50 (50% tissue cultureinfective dose) за 25 µl и 25 µl се прибавя във всяка епруветка, съдържаща 25 µl серумни разреждания. При скринингови изследвания се използва разреждане на серума до 1:10. Сместа от серум с вирус се инкубира за 60 минути при 37°C преди добавяне на 0,1 ml от VERO клетъчна суспензия (200 000 клетки/ml) във всяка епруветка. При титрация вирусният антиген се приготвя за тестване на четири разреждания по 25 µl на ямка. Плаките се инкубират на 37°C, 5% CO2, 95% влажност за 4 - 5 дни, при съдържание на вирус 30 - 100 TCID50. Плаките се фиксират и оцветяват с разтвор на 0,15% crystal violet in2% glutaraldehyde, след което се промиват. За 50% крайна точка на титъра на серума се изчислява по метода на Spearman-Karber и се определя отрицателният log10.