към чл. 7, ал. 1, т. 3 (Ново - ДВ, бр. 95 от 2006 г., в сила от 24.11.2006 г.) Африканска чума по конете (АЧК) Диагноза Реактивите за описания ензим, свързан имуносорбентен анализ (ЕЛАЙЗА), могат да бъдат получени от референтните лаборатории по АЧК на Европейската общност или референтните лаборатории на Международното бюро по епизоотии. 1. СРАВНИТЕЛНА ЕЛАЙЗА ЗА ДОКАЗВАНЕ НА АНТИТЕЛА НА ВИРУСА НА АФРИКАНСКА ЧУМА ПО КОНЕТЕ (АЧКВ) (ПРЕДПИСАН ТЕСТ) Сравнителната ЕЛАЙЗА се използва за доказване на специфични АКЧВ антитела в серуми от който и да е вид еднокопитни. Широкоспектърният, поликлонален, имунен анти-АЧКВ серум от морско свинче (наричан за по-кратко антисерум "морско свинче") е специфичен за серогрупата и може да докаже всички познати серотипове на вируса на АЧК. Принципът на тестуването се изразява в прекъсване на реакцията между АЧКВ антигена и антисерума "морско свинче" чрез тест серумна проба. АЧКВ антителата в тест серумната проба взаимодействат с тези в антисерума "морско свинче", което води до редукция на очаквания цвят (след добавяне на ензим, обозначен анти-морско свинче антитяло и субстрат). Серумите могат да бъдат тестувани при единично разреждане 1:5 (метод на петната) или могат да бъдат титрирани (метод на серумна титрация), за да се получи крайно разреждане. Инхибиторни стойности, по-високи от 50%, могат да се считат за положителни. Описаният протокол от изследване се използва в регионалната референтна лаборатория за АЧК в Пъртбрайт, Великобритания. 1.1. Тест процедура 1.1.1. Подготовка на плаките 1.1.1.1. ЕЛАЙЗА плаките се посяват с АЧКВ антиген, екстрахиран (извлечен) от заразени клетъчни култури и разреден в карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. ЕЛАЙЗА плаките се инкубират за една нощ при 4 °C. 1.1.1.2. Плаките се измиват три пъти чрез последователно пълнене и изпразване на гнездата (ямките) с фосфатно буфериран физ. (ФБФ), pH 7,2 до 7,4 pH, след което се изсушават и попиват с хигроскопична хартия. 1.1.2. Контролни ямки на плаките 1.1.2.1. Положителните контролни серуми се титрират в двойна серия разреждане, от 1:5 до 1:640, в колона 1 в блокиращ буфер (ФБФ, съдържащ 0,05% (v/v)Tween-20, 5,0% (w/v) обезмаслено мляко на прах (Cadbury's Marvel TM) и 1% (v/v) серум от възрастно говедо) до получаване на краен обем от 50 µl/ямка. 1.1.2.2. Към ямки A и B от колона 2 се добавя 50 µl от отрицателния контролен серум при разреждане 1:5 (10 µl серум + 40 µl блокиращ буфер). 1.1.2.3. Към ямки C и D от колона 2 (празна) се добавя 100 µl/ямка блокиращ буфер. 1.1.2.4. Към ямки E, F, G и H от колона 2 (контрол на морското свинче) се добавят 50 µl блокиращ буфер. 1.1.3. Метод на петната 1.1.3.1. Добавя се 1 към 5 на всеки тест серум в блокиращ буфер за дублиране на ямки от колони 3 до 12 (10 µl серуми + 40 µl блокиращ буфер). или 1.1.4. Метод на серумната титрация 1.1.4.1. Подготвя се двойна серия разреждане на всяка тест проба (1:5 до 1:640) в блокиращ буфер в осем ямки от единични колони (3 до 12), след което 1.1.5. Добавят се 50 µl антисерум "морско свинче", предварително разреден в блокиращ буфер, във всички ямки на ЕЛАЙЗА плаката с изключение на празните (така крайното количество, което се съдържа във всички ямки, е 100 µl). 1.1.5.1. Инкубира се в продължение на един час при 37 °C на/върху орбитален шейкър. 1.1.5.2. Плаките се измиват три пъти, след което се подсушават, както е описано в 1.1.1.2. 1.1.5.3. Към всяка ямка се добавят 50 µl конюгат: заешки анти-морско свинче/пероксидаза (HRP), предварително разтворен в блокиращ буфер. 1.1.5.4. Инкубира се в продължение на един час при 37 °C на/върху орбитален шейкър. 1.1.5.5. Плаките се измиват три пъти и се подсушават, както е описано в 1.1.1.2. 1.1.6. Хромоген Подготвя се хромогенният ОФД (ОФД = орто-фенилдиамин) разтвор съгласно инструкциите на производителя (0,4 mg/ml в стерилна дестилирана вода) непосредствено преди употреба. Добавя се субстрат (водороден диоксид прекис = H2O2) до получаване на крайна концентрация от 0,05% (v/v) (1:2000 на 30% разтвор на H2O2). Към всяко кладенче се добавят по 50 µl от ОФД разтвора, след което плаките се оставят на поставката за 10 минути при стайна температура. Реакцията се прекъсва чрез добавяне на 50 µl/кладенче на 1M сярна киселина (H2SO4). 1.1.7. Разчитане Разчитането става спектрофотометрично при 492 nm. 1.2. Представяне на резултатите 1.2.1. С помощта на пакет от софтуерни програми се отпечатват стойностите на оптичната плътност (ОП) и процентът на инхибиция (ПИ) за тест серумите и контролните серуми въз основа на средната стойност, отчетена в четирите "морско свинче" контролни кладенчета на плаката. Данните, представени като стойности на ОП и ПИ, се използват, за да се определи дали изследването е в приемливи граници. Горните контролни граници (ГКГ) и долните контролни граници (ДКГ) за контрола на морското свинче са между ОП стойности съответно 1,4 и 0,4. Крайният титър за положителния контрол, базиран на 50% ПИ, трябва да бъде 1:240 (в граници от 1:120 до 1:480). Всяка плака, която не отговаря на тези критерии, следва да се отхвърли. Въпреки това, ако титърът на серума за положителен контрол е повече от 1:480 и пробите са все още отрицателни, отрицателните проби могат да се приемат. Двойните серумни гнезда за отрицателен контрол и двойните празни гнезда трябва да дават ПИ стойности съответно между +25% и -25% и между +95% и +105%. Когато стойностите са извън посочените граници, това не означава, че плаката е невалидна, а е признак на оцветяване. 1.2.2. Диагностичният праг (пределна стойност) за тест серумите е 50% (ПИ 50%). Проби, даващи ПИ стойности, по-високи от 50%, се отчитат като положителни. Проби, при които се отчитат ПИ стойности, по-ниски от 50%, се считат за отрицателни. Проби, при които се отчитат ПИ стойности над и под прага за двойните кладенчета, се считат за съмнителни. Подобни проби могат да се тестват отново с тест на петната и чрез титриране. Положителните проби също могат да се титрират с цел да се установи степента на положителност. Метод за единична титрация 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +контр. Тест серуми 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 A 1:5 - контр. B 1:10 - 31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 контр. C 1:20 Празен D 1:40 Празен E 1:80 MC контр. F 1:160 MC контр. G 1:320 MC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 контр. H 1:640 MC 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 контр. - контр. = отрицателна контрола + контр. = положителна контрола MC контр. = контрола "морскосвински" серум Метод на титрация 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 +контр. Тест серуми A 1:5 - 1:5 1:5 контр. B 1:10 - 1:10 1:10 контр. C 1:20 Празен 1:20 1:20 D 1:40 Празен 1:40 1:40 E 1:80 MC 1:80 1:80 контр. F 1:160 MC 1:160 1:160 контр. G 1:320 MC 1:320 1:320 контр. H 1:640 MC 1:640 1:640 контр. - контр. = отрицателна контрола + контр. = положителна контрола MC контр. = контрола "морскосвински" серум 2. ИНДИРЕКТНА ЕЛАЙЗА ЗА ДОКАЗВАНЕ НА АНТИТЕЛА НА ВИРУСА НА АЧК (АЧКВ) (ПРЕДПИСАН ТЕСТ) Описаният по-долу тест отговаря на описанието на теста в Глава 2.1.11 от "Наръчник на стандартите за диагностични тестове и ваксини" на Международното бюро по епизоотии, 4 издание, 2000 г. Рекомбинантният протеин VP7 се използва като антиген за определяне на антитяло на вируса на АЧК с висок индекс на чувствителност и специфичност. Друго преимущество е това, че е устойчив и не е патогенен. 2.1. Тест процедура 2.1.1. Твърда фаза 2.1.1.1. ЕЛАЙЗА плаките се посяват с рекомбинантен АЧКВ-4 VP7, разреден в карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. Плаките се инкубират за една нощ при 4 °С. 2.1.1.2. Плаките се измиват пет пъти с дестилирана вода, съдържаща 0,01% (v/v) Туийн 20 (Тween 20) (разтвор за измиване), след което се попиват внимателно с абсорбираща материя, за да се отстранят остатъците от измиването. 2.1.1.3. Плаките се блокират с фосфатно буфериран физ. (ФБФ) +5% (w/v) обезмаслено мляко (сухо обезмаслено мляко NestleTM), 200 µl/ямка, в продължение на един час при 37 °С. 2.1.1.4. Блокиращият разтвор се отстранява, след което плаките се попиват с абсорбираща материя. 2.1.2. Тест проби 2.1.2.1. Серумните проби, които ще се тестват, както и положителните и отрицателните контролни серуми, се разреждат 1:25 във ФБФ +5% (w/v) обезмаслено мляко + 0,05% (v/v) Tween 20, 100 µl на ямка. Инкубира се за един час при 37 °С. За титрирането се прави двойна серия разреждане 1:25 (100 µl на ямка), един серум на колонка от плаката, като същото се повтаря за положителната и отрицателната контрола. Инкубира се за един час при 37 °С. 2.1.2.2. Плаките се измиват, както е описано в стъпка 2.1.1.2. 2.1.3. Конюгат 2.1.3.1. 100 µl/ямка пероксидаза, конюгирана с анти-кон гамаглобулин, разреден във ФБФ +5% мляко + 0,05% Tween 20, pH 7,2. Инкубира се в продължение на един час при 37 °С. 2.1.3.2. Плаките се измиват, както е описано в т. 2.1.1.2. 2.1.4. Хромоген/субстрат 2.1.4.1. Във всяка ямка се добавят 200 µl хромогенен/субстратен разтвор (10 µl 80,6 mM DMAB (диметил аминобензалдехид) +10 ml 1,56 mM MBHT (3-метил-2-бензо-тиазолин хидразон хидрохлорид) +5 µl H2O2). Оцветяването се прекратява чрез добавяне на 50 ml 3N H2SO4 приблизително след 5 до 10 минути (преди да е започнало оцветяване на отрицателната контрола). Могат да се използват и други хромогени като ABTS (2,2'-Azino-bis -[3-ethylbenzothiazoline-6-sulphonic acid]). 2.1.4.2. Разчитане на плаките при дължина на вълната 600 nm (или 620 nm). 2.2. Интерпретиране на резултатите 2.2.1. Пределната стойност се изчислява, като към стойността на отрицателната контрола се прибавя 0,6 (0,6 е стандартното отклонение, получено при група от 30 отрицателни серума). 2.2.2. Тест проби, при които се отчитат стойности на абсорбция, по-ниски от пределната стойност, се считат за отрицателни. 2.2.3. Тест проби, при които се отчитат стойности на абсорбция, по-високи от пределната стойност +0,15, се считат за положителни. 2.2.4. Тест проби, при които се отчитат междинни стойности на абсорбция, са съмнителни, което налага използването на втора техника за потвърждаване на резултата. 3. БЛОКИРАЩА ЕЛАЙЗА ЗА ДОКАЗВАНЕ НА АНТИТЕЛА НА ВИРУСА НА АЧК (АЧКВ) (ПРЕДПИСАН ТЕСТ) Чрез блокираща ЕЛАЙЗА се доказват специфични антитела на АЧКВ в серуми от възприемчиви към болестта животински видове. VP7 е основен антигенен вирусен протеин на АЧКВ, който е консервативен и за деветте серотипа. Тъй като моноклоналното антитяло също е насочено срещу VP7, изследването ще покаже висока степен на чувствителност и специфичност. Освен това, рекомбинантният VP7 антиген е напълно безвреден и следователно гарантира висока степен на безопасност. Принципът на теста се състои в прекъсване на взаимодействието между рекомбинантния VP7 като антиген, свързан с ЕЛАЙЗА плаката, и конюгираното моноклонално антитяло, специфично за VP7. Антитялото в тест серумите ще блокира взаимодействието между антигена и моноклоналното антитяло, което ще доведе до намаляване интензитета в оцветяването. Описаният тест се извършва в референтната лаборатория по АЧК на Европейската общност в Алхете, Испания. 3.1. Тест процедура 3.1.1. ЕЛАЙЗА плаки 3.1.1.1. ЕЛАЙЗА плаките се посяват с рекомбинантен АЧКВ-4 VP7, разреден в карбонатен/бикарбонатен буфер, pH 9,6. Инкубира се за една нощ при 4 °C. 3.1.1.2. Плаките се измиват пет пъти с фосфатно буфериран физ. (ФБФ), съдържащ 0,05% (v/v) Tween 20 (PBST). 3.1.1.3. Плаката се стабилизира със стабилизиращ разтвор (което позволява да се съхранява продължително време при 4 °C без загуба на дейност), след което се попива с абсорбираща материя. 3.1.2. Тест проби и контроли 3.1.2.1. Скрининг: тест серумите и контролите се разреждат в PBST 1:10 директно върху плаката до получаване на краен обем от 100 µl/ямка. Инкубира се един час при 37 °C. 3.1.2.2. Титриране: подготвя се двойна серия разреждане на тест серумите и положителните контроли (100 µl/ямка) от 1:10 до 1:1280 в осем ямки. Отрицателните контроли се тестват при разреждане 1:10. 3.1.3. Конюгат Във всяка ямка се добавя 50 µl предварително разредена h-пероксидаза (HRP)-конюгирана с Mab (моноклонални антитела, специфични за VP7) и се разбърква леко, за да се хомогенизира. Инкубира се 30 минути при 37 °C. 3.1.4. Плаките се измиват пет пъти с PBST и се попиват, както е описано в 3.1.1.2. 3.1.5. Хромоген/субстрат Добавят се 100 µl/ямка хромоген/субстратен разтвор (1 ml ABTS (2,2'-Azino-bis -[3-етилбензотиазолин-6-sulphonic acid]) 5 mg/ml + 9 ml субстратен буфер (0,1 M фосфат-цитратен буфер, pH 4, съдържащ 0,03% H2O2) и се инкубира в продължение на 10 минути при стайна температура. Оцветяването се прекратява чрез добавяне на 100 µl/ямка на 2% (w/v) SDS (sodium dodecyl sulphate). 3.1.6. Разчитане Разчитането става при дължина на вълната 405 nm в ELISA reader. 3.2. Интерпретиране на резултатите 3.2.1. Валидност на теста Тестът е валиден, когато оптичната плътност (ОП) на отрицателната контрола (ОК) е по-висока от 1,0, а ОП на положителната контрола (ПК) е по-ниска от 0,2. 3.2.2. Изчисляване на пределната стойност (прага) Положителен праг = ОК - ((ОК - ПК) x 0,3), Отрицателен праг = ОК - ((ОК - ПК) x 0,2), където ОК е ОП на отрицателната контрола, а ПК - ОП - на положителната контрола. 3.2.3. Интерпретиране на резултатите Проби с ОП, по-ниска от положителния праг, се считат за положителни на антитела на АЧКВ. Проби с ОП, по-висока от отрицателния праг, се считат за отрицателни на антитела на АЧКВ. Проби с ОП между тези две стойности се считат за съмнителни и след две до три седмици се взимат нови проби от животните.