към чл. 4, ал. 2, т. 2 Диагностично ръководство I. Описание на причинителя и на заболяването Заболяването африканска чума по свинете (АЧС) се причинява от вирус, който се причислява към т. нар. семейство на ASF-like вирусите. Вирусът на АЧС предизвиква разнообразни синдроми, вариращи от перакутно до хронично заболяване, а така също и перзистенция при външно здрави вирусоносители. По-силно вирулентните щамове предизвикват перакутна или акутна хеморагична инфекция, характеризираща се с висока температура, загуба на апетит, хеморагии по кожата и вътрешните органи и смърт след 2 до 10 дни. Смъртността може да достигне до 100 %. Щамовете с по-ниска вирулентност причиняват “меки” клинични признаци - слабо повишаване на телесната температура, намален апетит и депресия, които могат лесно да се сбъркат с тези при други заболявания по свинете и да не доведат до подозрение за заболяването АЧС. Авирулентните, нехемадсорбиращи щамове на вируса предизвикват субклинична нехеморагична инфекция и сероконверсия, но някои животни могат да развият скрити лезии по белите дробове или по кожата в областите над костите и в други зони, податливи на травми. Африканската чума по свинете не може да бъде диференцирана от класическата чума по свинете само чрез клинично и постмортално обследване. Двете заболявания се имат предвид при диференциална диагноза на всеки акутен фебрилен хеморагичен синдром при прасетата, какъвто се наблюдава например при бактериални септицемии. Лабораторните изследвания са основни при разграничаване на заболяванията. II. Изисквания за биобезопасност на Националната лаборатория за африканска чума по свинете 1. Оценка на риска Вирусът на АЧС не представлява риск за човешкото здраве. Правилата за биобезопасност предотвратяват разпространението на инфекциозен вирус от лабораторията към възприемчивата популация от свине. Вирусът спада към ОIЕ “Група 3”: предизвиква заболяване, което е обект на контрол от органите на НВМС и има огромен риск за разпръскване от лабораторията. 2. Общи принципи на работната среда Изискват се обособени помещения за различните процедури: 2.1. задължително разположено в АЧС звеното помещение за аутопсии и постмортални обследвания, оборудвано с филтър, възможности за къпане и преобличане на персонала и двупроходен автоклав за унищожаване на високорисков биологичен материал; 2.2. биообезопасена лаборатория за работа с диагностични проби и процедури с жив вирус (задължително ниво III на биобезопасност); 2.3. филтър с душове и съблекалня, базирана на входа/изхода на биообезопасената лаборатория; 2.4. помещение за хладилници и фризери; 2.5. помещение за микроскопиране, включително затъмнена част за работа с флуоресцентен микроскоп; 2.6. “чиста” стая за подготовка на клетъчни култури, среди и посуда; 2.7. лаборатория за серологични изследвания с използване на инактивиран антиген; 2.8. помещение за персонала. 3. Лабораторно облекло При работа с биологичен материал, трупове, диагностични проби от терена, кръв и опитно заразяване на лабораторни животни се използват: работно облекло за еднократна употреба, покриващо плътно всички части на тялото, ръкавици, шапки, очила и маски. Работното облекло, стъкларията и инвентарът подлежат на унищожаване след приключване на манипулациите. При работа с инактивиран антиген се допуска използването само в серологичната лаборатория на работно облекло, което се пере, суши и глади в лабораторията. Стерилизацията на стъкларията и инвентара се извършва също само в лабораторията. 4. Контрол на персонала В лабораторията за диагностика на АЧС се допускат през мокър филтър поименно само лица от персонала, придобили съответната квалификация и инструктирани срещу подпис за работа с особено опасен вирус. На персонала не се разрешава да има достъп до прасета 48 часа след напускане на лабораторията. 5. Оборудване 5.1. ламинарен бокс (клас III) с двойна НЕРА филтрация; 5.2. фризер (минус 70 °С); 5.3. фризер (минус 20 °С); 5.4. хладилници (минус 4 °С); 5.5. тъканен хомогенизатор; 5.6. инкубатор; 5.7. криостатен микротом; 5.8. флуоресцентен микроскоп; 5.9. светлинен микроскоп; 5.10. охлаждаща центрофуга; 5.11. ултрацентрофуга; 5.12. бидестилатор; 5.13. двупроходен автоклав; 5.14. перална машина със сушилня и ютия; 5.15. общо лабораторно оборудване: везни, рН метър, миксер, водна баня, многоканални и едноканални пипети с обем от 10 до 1000 ml и съответни еднократни наконечници, еднократна посуда за рутинни вирусологични изследвания и поддържане на клетъчни култури, хранителни среди и реактиви; 5.16. ELISA система: инкубатор, миещо устройство, рийдер за спектрофотометрично отчитане на плаки, компютър със съответен софтуер и принтер; 5.17. PCR оборудване. 6. Вирусни щамове Всички изолати на вируса на АЧС се съхраняват дълбоко замразени в заключен фризер, който не се използва за съхраняване на други вируси и материали, несвързани с диагностиката на АЧС. Използват се индивидуални ампули, щателно номерирани, с етикет. Води се стриктна конфиденциална документация за вирусните щамове: произход, дати и резултати от контролните изследвания в лабораторията, както и резултатите от генетичното типизиране на Референтната лаборатория на Европейския съюз. 7. Опитни животни Използването на опитни животни не се препоръчва. В случай на крайна необходимост с изричното писмено разрешение на генералния директор на НВМС се допуска провеждането на биологичен опит в биообезопасено звено в рамките на лабораторията за АЧС при строги мерки за сигурност, денонощна охрана и с участието само на персонала на лабораторията. Всички опитни животни се унищожават в рамките на звеното след приключване на опита, труповете се обезвреждат и изгарят. III. Диагностични методи 1. Доказване на вируса 1.1. Проби и подготовка на пробите за изследване. При подозрение за АЧС в референтната за страната лаборатория се изпращат следните проби: кръв в антикоагулант (хепарин или етилен диамин тетраоцетна киселина - EDTA), далак, тонзили, бъбреци, лимфни възли. Пробите по време на транспорта се съхраняват колкото се може по-добре охладени, без да се замразяват. За провеждане на реакция хемадсорбция и инокулация на прасета от тъканите се изготвя суспензия чрез нарязване на малки парченца и стриване в хаван или с помощта на тъканен хомогенизатор. След това се добавя 5 - 10 ml буфериран солеви разтвор или среда за клетъчни култури, съдържащи антибиотици. Суспензиите се пречистват чрез центрофугиране при 1000 g за 5 min. За постановка на реакция хемадсорбция и за инокулация на прасета се използва супернатантата. 1.2. Реакция хемадсорбция (HT). Тестът е основен и определящ за АЧС поради факта, че свинските еритроцити адхезират по повърхността на свински моноцити или макрофаги, заразени с вируса на АЧС, като повечето изолати на този вирус предизвикват феномена хемадсорбция. Изолирани са много малко нехемадсорбиращи вируси, повечето от които са авирулентни, но някои могат да причинят типична акутна форма на болестта. Реакцията се провежда чрез заразяване на първични левкоцитни култури с кръв или тъканни суспензии от съмнително болни прасета (процедура 1) или чрез изготвяне на левкоцитни култури от кръв на заразени в лабораторията прасета или такава от съмнително болни прасета на терена (процедура 2). От 100 ml събрана дефибринирана или хепаринизирана кръв могат да се приготвят до 300 култури. Основно правило е всички процедури да се извършат по начин, предпазващ от контаминиране на културите. Процедура 1. HT в първични левкоцитни култури Прясна кръв от прасе се обработва с хепарин (100 IU/ml кръв), центрофугира се при 700 g за 30 min, левкоцитите се изваждат, промиват се със среда, ресуспендират се до концентрация от 10 на 7 степен клетки/ml в среда за клетъчни култури, съдържаща 10 - 30 % свински серум и антибиотици. За избягване на неспецифична хемадсорбция средата трябва да съдържа серум или плазма от същото прасе, от което са добити левкоцитите. Клетъчната суспензия се разлива в епруветки 160 ґ 16 mm в равно количество от 1,5 ml, които се инкубират в положение 5 - 10 °С към хоризонталата при 37 °С. Достатъчно чувствителни към вируса за рутинна диагностика са културите на възраст от 2 до 4 дни. Три от епруветките се заразяват чрез добавяне на 0,2 ml за епруветка от приготвените тъканни проби, като е препоръчително заразяване да се извърши и с десетократни и стократни разреждания на пробите - от особена важност, когато теренният материал е доставен при лоши условия. Залагат се положителни и отрицателни контроли чрез заразяване съответно с хемадсорбиращ вирус и без заразяване за разкриване на възможна неспецифична хемадсорбция. След 3 дни във всяка една от епруветките се добавя по 0,2 ml прясно приготвена 1 %-на суспензия от еритроцити в буферен разтвор. В продължение на следващите 7 - 10 дни културите се наблюдават ежедневно под микроскоп за наличие на цитопатичен ефект (ЦПЕ) и на хемадсорбция. Отчитане на резултатите: Хемадсорбцията се състои в струпване на голямо количество свински еритроцити по повърхността на заразените клетки. Цитопатичният ефект се състои в отсъствие на адхезиращи клетки при отсъствие на хемадсорбция. Вероятните причини за наличието на ЦПЕ са: цитотоксичен ефект на инокулума, наличие на вируса на Ауески или наличие на нехемадсорбиращ вирус на АЧС, който обаче може да бъде доказан чрез DIF или чрез PCR. При отсъствие на изменения или ако резултатите от DIF и PCR са отрицателни, наложително е ново заразяване на пресни левкоцитни култури със супернатантата от старите. Процедура 2. HT в левкоцитни култури от периферна кръв на заразени прасета Процедурата е по-лесна от подготовката и инокулацията на първични свински левкоцитни култури и дава по-бързи резултати при положителни случаи. Тя може да се изпълни в лаборатории, които не са оборудвани за рутинна вирусологична диагностика: минимални изисквания са наличието на предметни и покривни стъкла, микроскоп, стерилна среда, епруветки и пипети. Кръвта, взета от подозрителни прасета на терена и от такива, инокулирани в лабораторията, се обработва с хепарин и левкоцитните култури се събират за директно наблюдение за хемадсорбция. Вземат се 20 ml от цяла кръв в спринцовка, съдържаща 2000 IU хепарин в 2 ml буферен разтвор, размесват се и се прехвърлят в стъклена епруветка. Епруветката се поставя вертикално в инкубатор или във водна баня при 37 градуса С и се изчаква утаяването на клетките. Седиментацията се подобрява чрез добавяне на 2 ml разтвор на Декстран 150 в 0,9 % натриев хлорид. Културите се инкубират за 6 - 8 h при 37 °С, след което малки количества от супернатантата, съдържаща бели кръвни клетки, заедно с еритроцити се наблюдават под микроскоп върху предметно стъкло за наличие на хемадсорбция. 1.3. Доказване на антиген на вируса на АЧС чрез директен имунофлуоресцентен метод (DIF). DIF се използва за доказване на антиген на АЧС в тъкани от подозрителни прасета от терена или на такива, заразени в лабораторията. Допълнително методът може да се използва за доказване на същия в левкоцитни култури, в които не се е наблюдавала хемадсорбция, като по този начин се идентифицират нехемадсорбиращите щамове на вируса. Чрез DIF се разграничава също цитопатичният ефект, предизвикан от вируса на АЧС и от други вируси, например вируса на болестта на Ауески или от този вследствие заразяване с цитотоксичен инокулум. Процедура Изготвят се криостатни срезове, отпечатъчни препарати от изследваните тъкани или от клетъчния седимент от заразени левкоцитни култури върху предметни стъкла, изсушават се на въздух и се фиксират с ацетон за 10 min при стайна температура. Обработват се с флуоресцеин изотиоцианат (FITC) конюгиран антивирус АЧС имуноглобулин в работно разреждане за 1 h при 37 °С във влажна камера. Едновременно с това се фиксират и обработват с конюгат положителни и отрицателни препарати. След промиване с фосфатно-буферен разтвор и обработка на препаратите с глицеринов буфер същите се наблюдават под ултравиолетов светлинен микроскоп. Отчитане на резултатите: Положителни за присъствие на АЧС вирусен антиген са проби, в които се наблюдава специфична грануларна цитоплазматична флуоресценция в паракортикалните тъкани на лимфоидните органи или във фиксираните макрофаги в другите органи. 1.4. Доказване наличието на вирусна нуклеинова киселина чрез полимеразно-верижна реакция (PCR). Чрез PCR-техниката се доказват и идентифицират широк кръг от изолати, принадлежащи към всички известни генотипове на вируса, включително нехемадсорбиращи вируси и изолати с ниска вирулентност. Реакцията е подходяща за идентификация на вирусната ДНК в загнили тъкани, които не са подходящи за вирусна изолация и доказване на антиген. Изследванията за генетично типизиране на вируса чрез PCR се извършват в Референтната лаборатория за АЧС на Европейския съюз, Валдеомос, Мадрид, Испания. 1.5. Биологична проба (инокулация на прасета). Използва се за разграничаване на АЧС от класическата чума по свинете (КЧС), които имат неразличими клинични и патологоанатомични признаци. Заразяват се две групи прасета, животните в едната от които са били ваксинирани срещу КЧС, а в другата са неваксинирани. След заразяване в случай на АЧС умират прасетата и от двете групи, а в случай на КЧС - само тези от групата с неваксинирани животни. 2. Доказване на антитела срещу вируса на АЧС 2.1. Ензим-свързан имуносорбентен метод (ELISA). Методът е директен и с него може да се доказва наличието на антитела срещу вируса на АЧС у прасета, които са били инфектирани с ниско или средно вирулентни вирусни щамове на АЧС. Приготвяне на антиген Антигенът се приготвя от заразени с вируса на АЧС клетки, в растежната среда на които присъства свински серум. За целта с адаптиран вирус се заразява стабилна линия от маймунски клетки, след което същите се инкубират в среда, съдържаща 2 % свински серум, за период от 36 - 48 h, докато цитопатичният ефект е екстензивен. Промиват се с фосфатно-буферен разтвор, седиментират се при 650 g за 5 min, клетъчният пелет се промива в 0,34 М захароза в 5 mM Tris-HCl, рН 8,0 и се центрофугира за пелетиране на клетките. При температура, по-ниска от 0 °С, утайката с клетки се ресуспендира в 67 mM захароза в 5 mM Tris-HCl, рН 8,0; след 10 min се добавя детергент без йони до крайна концентрация от 1 %; изчаква се 10 min до лизиране на клетките, добавя се захароза до крайна концентрация от 64 % в 0,4 М Tris-HCl, рН 8,0 и се центрофугира при 1000 g за 10 min. Супернатантата се събира, добавя се EDTA (2 mM крайна концентрация), бета-меркаптоетанол (50 mM крайна концентрация) и NaCl (0,5 М крайна концентрация) в 0,25 mM Tris-HCl, рН 8,0. Инкубира се за 15 min при 25 °С. Центрофугира се при 100 000 g за 1 h при 4 °С върху подложка от 20 % захароза в 50 mM Tris-HCl, рН 8,0. Антигенът се съхранява при минус 20 °С. Процедура ELISA плаката се натоварва с антиген чрез накапване във всяка ямка по 100 ml от работно разреждане на антигена в 0,05 М карбонатно-бикарбонатен буфер с рН 9,6. Плаката се инкубира при 4 °С за 16 h (една нощ), след което се промива петкратно с 0,05 % Tween 20 в PBS, рН 7,2. Изследваните серуми, положителните и отрицателните контролни серуми се разреждат 1:30 в 0,05 Tween 20 в PBS, рН 7,2 и се накапват по 100 ml от всеки серум двойно в ямките на натоварената плака. В различни части на плаката се накапват четири двойки от всеки положителен и отрицателен серум. Инкубира се при 37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с 0,05 % Tween 20 в PBS, рН 7,2. Във всяка ямка се накапва по 100 ml конюгат протеин-А/пероксидаза в 0,05 % Tween 20 в PBS, инкубира се при 37 °С за 1 h, след което петкратно се промива с 0,05 % Tween 20 в PBS. Във всяка ямка се накапва по 100 ml субстрат (10µmml водороден прекис в 25 ml 0,04 % ортофенилендиамин във фосфатно-цитратен буфер, рН 5,0), инкубира се на стайна температура около 10 min, като след промяната на цвета реакцията се стопира чрез добавяне на 100 ml 3 N сярна киселина. Отчитане на резултатите Резултатите се отчитат чрез спектрофотометрично изследване при 492 nm на ELISA ридер. За положителен се счита всеки серум, който има абсорбатно ниво, по-високо от двойното средно абсорбатно ниво на контролните отрицателни серуми на плаката. 2.2. Индиректен имунофлуоресцентен метод (IDIF). Методът се използва като потвърдителен за кръвни серуми от зони, свободни от АЧС, които са били положителни в ELISA, и за серуми от ендемични зони, показали съмнителен резултат при ELISA. Приготвя се суспензия от заразени с вируса на АЧС клетъчни култури от свински бъбрек или клетъчна линия от маймунски клетки в концентрация 5 ґ 105 клетки/ ml, малки капки се наслояват върху предметни стъкла, изсушават се на въздуха и се фиксират с ацетон при стайна температура за 10 min. Съхраняват се при минус 20 °С. Изследваните серуми се загряват при 56 °С за 30 min. След разреждане в буферен солеви разтвор същите заедно с положителни и отрицателни контролни серуми се накапват върху препаратите от заразени и незаразени клетъчни култури, инкубират се за 1 h при 37 °С във влажна камера, след което се промиват с PBS и с дестилирана вода. Върху всички препарати се накапва антисвински имуноглобулин-FITC конюгат или протеин А-FITC конюгат в работно разреждане, след което същите се инкубират за 1 h при 37 °С във влажна камера. Препаратите се промиват с PBS и с дестилирана вода, накапват се с PBS (глицеролов буфер) и се наблюдават под ултравиолетов светлинен микроскоп. След установяване на положителен резултат от положителния контролен серум върху заразени клетъчни култури и отрицателен резултат при всички останали контролни препарати тестът може да бъде отчетен. Серумите са положителни, когато заразените клетъчни култури показват специфична флуоресценция. Като потвърдителни тестове в някои диагностични лаборатории могат да се използват методите имуноблотинг и имуноелектроосмоза. IV. Референтни диагностични лаборатории на Общността Белгия Centre d’йtude et de recherche vйtйrinaires et agrochimiques, 1180 Bruxelles Чехия Institute of Animal Health, Ash Road, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF Дания Danmarks Veterinжre Institut – Afdeling for Virologi, Lindholm, 4771 Kalvehave Германия Bundesforschungsanstalt fьr Viruskrankheiten der Tiere, Tьbingen, 17498 Riems Естония Veterinaar-ja Toidulaboratoorium Kreutzwaldi 30 51006 Tartu Гърция Veterinary Institute of Infectious and Parasitic Diseases, 15310 Ag. Paraskevi Испания Centro de Investigaciуn en Sanidad Animal, 28130 Valdeolmos (Madrid) Франция AFSSA-Ploufragan, Zoopole des Cфtes d’Armor, 22440 Ploufragan Ирландия Veterinary Research Laboratory, Abbotstown, Castleknock, Dublin 15 Италия Istituto Zooprofilattico Sperimentale dell’Umbria e delle Marche, 06100 Perugia Кипър Τμ?μα Κτηνιατρικ?ν Ιδρυμ?των Διε?θυνση Κτηνιατρικ?ς και Δημ?σιας Υγε?ας Γενικ? Διε?θυνση Κτηνιατρικ?ς Υπουργε?ο Γεωργ?ας Αχαρν?ν 2, 10176 Αθ?να Латвия Valsts veterinarmedicinas diagnostikas centrs Lejupes iela 3 LV-1076 Riga Литва Nacionaline veterinarijos laboratorija J. Kairiukšcio g. 10 LT-2021 Vilnius Люксембург Laboratoire de mйdecine vйtйrinaire de l’Йtat, 1020 Luxembourg Унгария Orszбgos Бllategйszsйgьgyi Intйzet (OБI) Pf. 2. Tбbornok u. 2. HU-1581 Budapest Малта Institute for Animal Health Pirbright Laboratory Ash Road Pirbright Woking Surrey GU24 ONF United Kingdom Холандия Central Institute for animal disease control (CIDC-Lelystad), P.O. Box 2004, 8203 AA Lelystad Австрия Bundessanstalt fьr veterinдrmedizinische Untersuchungen in Mцdling, Robert Koch-Gasse 17, 2340 Mцdling Полша Laboratorium Zakladu Pryszczycy Panstwowego Instytutu Weterynaryjnego ul. Wodna 7 PL-98-220 Zdunska Wola Португалия Laboratуrio Nacional de Investigaзгo Veterinбria, 1500 Lisboa Словения Nacionalni veterinarski inљtitut Gerbiceva 60 SI-1000 Ljubljana Словакия Stбtny veterinбrny ъstav Pod drбhami 918 SK-960 86 Zvolen Финландия Elдinlддkintд- ja elintarviketutkimuslaitos, 00231 Helsinki Forskningsanstalten fцr veterinдrmedicin och livsmedel, 00231 Helsingfors Швеция Statens Veterinдrmedicinska Anstalt, 75189 Uppsala Великобритания Institute for Animal Health, Pirbright, Woking, Surrey GU24 ONF