към чл. 4, ал. 2, т. 2 Диагностично ръководство I. Минимални изисквания за биобезопасност на Националната лаборатория по класическа чума по свинете 1. Оценка на риска Вирусът на КЧС не представлява риск за човешкото здраве. Правилата за биобезопасност предотвратяват разпространението на инфекциозен вирус от лабораторията към възприемчивата популация от свине. Вирусът спада към ОIЕ “Група 3”: предизвиква заболяване, което е обект на контрол от органите на НВМС и има умерен риск за разпръскване от лабораторията. 2. Общи принципи на работната среда Нормално атмосферно налягане, обособени помещения за различните процедури, както следва: - за постмортални обследвания - с мивка, възможности за почистване и дезинфекция; допуска се разположение извън КЧС звеното; - биообезопасена лаборатория за работа с диагностични проби и процедури с жив вирус (задължително ниво III); - съблекалня с душове и/или мивки, базирана на входа/изхода на биообезопасената лаборатория; - помещение за хладилници и фризери; - помещение за микроскопиране, вкл. затъмнена част за работа с флуоресцентен микроскоп; - “чиста” стая за подготовка на клетъчни култури, среди и стъклена посуда; - лаборатория за серологични изследвания с използване на инактивиран антиген; - помещение за персонала. 3. Лабораторно облекло Връхно работно облекло, използвано само в лабораторията, ръкавици за еднократна употреба при всички манипулации с инфектиран материал, стерилизация на посудата и пране на облеклото - в лабораторията. 4. Контрол на персонала В лабораторията влизат само поименно обучени лица. На персонала не е разрешено да имат достъп до прасета 48 h след напускане на лабораторията. 5. Оборудване - ламинарен бокс (клас I или II) с двойна НЕРА филтрация; - фризер ( - 70 °C); - фризер ( - 20 °С); - хладилници ( - 4 °С); - криостатен микротом; - хомогенизатор; - инкубатор (за предпочитане СО2); - инвертен светлинен микроскоп; - флуоресцентен микроскоп; - центрофуга; - бидестилатор; - автоклав; - перална машина със сушилня и ютия; - общо лабораторно оборудване: везни, рН метър, миксер, шейкър, водна баня, многоканални и едноканални пипети с обем от 1 до 300 ml със съответните наконечници; - ELISA система - инкубатор клатачка, миещо устройство, рийдер за фотометрично отчитане на плаки, компютър със съответния софтуер и принтер. 6. Вирусни щамове Всички изолати на вируса се съхраняват на сигурно място дълбоко замразени във фризер, който не се използва за съхраняване на други вируси и материали, несвързани с диагностиката на КЧС. Използват се индивидуални ампули, щателно номерирани, с етикет. Води се стриктна документация за вирусните щамове - произход, дати и резултати от контролните изследвания. 7. Опитни животни Всички опитни животни се унищожават преди напускане на звеното. Труповете се изгарят след приключване на изследването. II. Клинично и постмортално обследване Клиничните признаци и постморталните лезии при прасетата, инфектирани с вируса на КЧС, силно варират в зависимост както от свойствата на вируса, така и от състоянието на животните. 1. Заболяването протича в остра, хронична и конгенитална форма а) при острата форма - избухване на заболяването във всички възрастови групи, съпроводено с пирексия, треперене, липса на апетит, вялост, отслабване, конюктивити, констипация, последвана от диария; няколко дни след това ушите, коремът и вътрешната страна на бедрата се оцветяват червено-синьо-виолетово; животните умират за 1 - 2 седмици; внезапната смърт и липсата на клинични признаци не са симптоматични за КЧС; б) при известни обстоятелства, свързани с възрастта и кондицията на животните, а също и с включения вирусен щам, може да се развие подостра или хронична форма, която се протрахира от 2 - 4 седмици или месец; наблюдава се спиране на растежа, анорексия и интермитираща пирексия и диария; в) конгениталната перзистираща инфекция може да не бъде открита месеци и да засегне само няколко прасила във фермата; клиничните признаци са неспецифични: изтощение при липса на перексия. Хроничната и перзистиращата инфекция винаги водят до смърт на животното. Вирусът засяга имунната система, най-важният признак е генерализираната левкопения, което често се установява преди появата на треска. Имуносупресията може да доведе до развитието на конкурентна инфекция. 2. Постмортални изменения а) при острата форма: в типичните случаи лимфните възли са хеморагични, хеморагии се наблюдават в епикардиума, в бъбреците, пикочния мехур, по кожата и подкожно; б) в субакутните (хроничните) случаи - некрози или “бутонни” язви се наблюдават в мукозата на гастроинтестиналния тракт, епиглотиса и ларинкса като допълнение на останалите лезии. Хистопатологичните находки не са патогномични. Лезиите могат да включват паренхиматозна дегенерация на лимфоидната тъкан, клетъчна пролиферация на васкуларната интерстициална тъкан и негноен менингоенцефалит. Вариабилността на клиничните признаци и постморталните лезии не дават възможност да се установи недвусмислена диагноза. Предполагаемата диагноза, базирана на клиничните признаци и постморталните лезии, трябва своевременно да бъде потвърдена чрез лабораторни изследвания. III. Правила за вземане и обработка на проби от свине за серологично и вирусологично изследване 1. Кръвни проби се вземат в стерилни стъклени флакони при стриктно спазване на правилата за антисептика. 2. След напълване на флакона с кръв до 2/3 от обема му той се оставя в изправено положение за около 20 - 30 min на стайна температура за отделяне на кръвен серум. 3. След отделяне на кръвен серум той се прелива в стерилни стъклени флакони и плътно се затваря. 4. Пробата кръвен серум се съхранява дълбоко замразена във фризер. 5. За вирусологично изследване се вземат: цял далак, един бъбрек и тонзили (или ретрофаренгиални лимфни възли), които се изпращат в лабораторията в охладено състояние. При невъзможност взетите проби от вътрешни органи се поставят в полиетиленов плик и се съхраняват до транспортирането им в лабораторията по КЧС във фризер. 6. Кръвните проби и пробите от вътрешни органи се идентифицират чрез номера, които се описват в придружителното писмо. 7. Пробите се транспортират до лабораторията в хладилна чанта, придружени от писмо, издадено от официален ветеринарен лекар. Схема за вземане на кръвни проби от свине Брой животни: Брой кръвни проби: До 9 бр. свине 2 От 10 до 49 бр. свине 5 От 50 до 99 бр. свине 7 От 100 до 199 бр. свине 10 От 200 до 399 бр. свине 15 От 400 до 999 бр. свине 20 Схема за вземане на проби за серологично и вирусологично изследване от свине по време на клане и извършване на месопреглед в кланици Брой животни: Брой проби: От 1 до 9 бр. свине 5 От 10 до 29 бр. свине 10 От 30 до 49 бр. свине 25 От 50 до 99 бр. свине 50 От 100 до 200 бр. свине 70 IV. Доказване на вируса 1. Пряк имунофлуоресцентен метод за доказване на антиген Методът се прилага за детекция на КЧС антиген в криосрезове от сливици, далак, бъбреци или дисталните части на илеума. Органите, събрани от няколко животни, се събират и транспортират без консерванти, охладени, но не замразени. Криосрезовете се обработват директно с анти-КЧС-имуноглобулин, конюгиран с флуоресцеин-изотиоцианат (ФИГЦ), и се наблюдават чрез флуоресцентен микроскоп. Сливиците са най-подходящият орган, защото първи се инфектират с вируса, независимо от начина на заразяване. В случаите на субакутни и хронични форми най-често положителен е илеумът и е единственият орган, който дава положителна флуоресцентна реакция. Процедура Във всяка от сериите криосрезове от органи се изследват положителни и отрицателни срезове: - отразяват се кубчета от органите приблизително с размери 1 ґ 1 ґ 0,5 cm и се закрепват с дестилирана вода към криостатната масичка; - замразяват се в криобара на криостата; - срязват се криосрезове с дебелина не повече от 4 ml и се залепят върху покривни стъкла с големина 10 ґ 32 mm; - криосрезовете се фиксират за 10 min в хладилна камера в ацетон и се изсушават за 20 min при 37 °С; - криосрезовете се промиват еднократно с ПБС за 5 min; - КЧС конюгатът се разрежда в работно разреждане, покрива се криосрезът и се инкубира за 30 min при 37 °С; - след промиване с ПБС криосрезовете се обработват с Евансово синьо в концентрация 1:20 000 за 10 min; - трикратно промиване за по 5 min с ПБС и еднократно - с дестилирана вода; - криосрезовете върху покривните стъкла се отцеждат върху филтърна хартия, залепят се на предметно стъкло с глицеринов буфер, след което се наблюдават на флуоресцентен микроскоп. Същата процедура се прилага и при използване на прекия имунофлуоресцентен метод за доказване на вирус в клетъчни култури. 2. Биологична проба Биологичната проба се извършва в определена от НВМС база. Биологичната проба се провежда върху три прасета на 3 - 5-месечна възраст, ваксинирани срещу КЧС, най-малко 30 - 50 дни преди залагането и върху три неваксинирани прасета на същата възраст. Прасетата се инокулират интрамускулно с по 2 ml 1:10 емулсия от далак и лимфни възли на болно или умряло със съмнение за КЧС прасе. Опитните прасета се наблюдават в продължение на 30 дни при ежедневно термометриране и строга охрана. При умиране на всичките 6 прасета с клинични признаци и патологоанатомични изменения за класическа и африканска чума по свинете диагнозата е положителна за африканска чума. При умиране само на контролните неваксинирани прасета диагнозата е положителна за КЧС. 3. ELISA за откриване на гликопротеин ЕRNS/gp 44/48/ на вируса на класическата чума по свинете Плаките на кита са покрити с моноклонални антитела срещу гликопротеина Еrns на вируса на КЧС. В случай на присъствие на този гликопротеин в серума или плазмата, или тъканносвързан Еrns произтича специфично свързване с моноклоналните антитела от плаката. Несвързаните компоненти се отмиват, добавя се свързан с пероксидаза (белязан) анти-Еrns-конюгат, който се свързва с комплекса антиген-антитяло върху плаката. Несвързаният конюгат се отмива и се добавя хромоген. Степента на цветната реакция е правопропорционална на количеството кликопротеин Еrns в пробата. Диагностичната стойност на реакцията се проверява чрез сравняване на оптичната плътност в ямките с пробите и в тези с положителна и отрицателна контрола. Процедура Всички реагенти се темперират. Разтворите за миене на плаките и разредителите на пробите, конюгата и контролите се разреждат съгласно описанието. Във всеки две ямки след аплицирането на разредител (50 ml) се накапват пробите (серум, плазма или органа суспензия 1:10) в количество 150 ml. Едновременно с пробите се накапват и по две ямки с положителна и отрицателна контрола. Компонентите се смесват чрез внимателно тръскане на плаката, тя се покрива и се инкубира 60 min при 37 °С във влажна камера. Плаката се промива двукратно. Във всяка ямка се накапва разреден 1:200 конюгат, 200 ml и се инкубира за 60 min при 37 °С във влажна камера. Плаката се промива двукратно. Във всички ямки се накапва по 200 ml хромоген. Резултатите се отчитат чрез фотометриране (ридер на “Санофи”), след като разликата между оптичните плътности на отрицателната и положителната контрола е по-голяма или равна на 0,4. Това се отчита обикновено след 15 до 40 min след апликацията на хромогена. Във всяка от ямките се накапва по 50 ml стопиращ реакцията разтвор. V. Доказване на антитела 1. ELISA за откриване на антитела срещу гликопротеин Е2 (gp 55) Плаките са покрити с рекомбинантен Е2 гликопротеин. В случай на присъствие на антитела в пробите същите се свързват с антигена и предотвратяват свързването му с белязан с пероксидаза Е2 специфичен конюгат. Несвързаните компоненти се отмиват от плаката. Ако в пробата има специфични антитела, цветът не се променя след добавянето на хромоген. В случай че няма антитела, се наблюдава зелено оцветяване. Степента на цветната реакция е правопропорционална на присъствието на специфични антитела в пробата. Диагностичната стойност на теста се определя по оптичната плътност на положителната и отрицателната контрола. Процедура Всички реагенти се темперират. Концентрираните разтвори за миене на плаките и за разреждане на контролите, пробите и конюгата се разреждат по описание. Във всяка плака се аплицира по 75 ml разредител във всяка ямка и се накапва в две последователни ямки по 50 ml от пробата (серум или плазма). Компонентите се смесват чрез внимателно разклащане на плаката и същата се покрива и инкубира за 90 min във влажна камера. Плаката се промива двукратно. Във всяка ямка на плаката се накапва по 100 ml конюгат в разреждане 1:200. Инкубира се при 37 °С за 30 min. Плаката се промива двукратно. Във всяка ямка се накапва по 100 ml хромоген. След като разликата между оптичната плътност на отрицателната и положителната контрола стане по-голяма или равна на 0,3, реакцията се отчита със “Санофи” ридер фотометрично (20 до 30 min след добавянето на хромоген). Преди отчитането реакцията се спира чрез добавяне във всяка ямка по 50 ml стопинг разтвор. 2. ELISA за доказване на антитела срещу CSFV - Erns (разграничителен тест) Кратко описание: Тестът се използва за детекция в серум на антитела срещу Еrns - протеина на вируса на КЧС. Тестът е основан на блокиране чрез специфичните серумни антитела на свързването между Еrns - с пацифични моноклонални антитела и Еrns - протеина. Предназначен е за разграничаване на антителата, образувани след ваксинация с Е2 субединична ваксина, и на тези, образувани след ваксинация с конвенционална ваксина или след размножаването на теренен вирус на КЧС в организма на свинете. Процедура 2.1. Всички реагенти, съдържащи се в кита и допълнителните плаки, се темперират. 2.2. Референтните серуми се реконституират с деминерализирана вода. 2.3. Конският серум и антигенът се реконституират с дестилирана или деминерализирана вода. 2.4. Приготвя се ELISA буфер от предварително разредения с дестилирана или деминерализирана вода разтварящ буфер и 5 % конски серум. 2.5. Антигенът и конюгатът се довеждат до работно разреждане с ELISA буфер. 2.6. Приготвя се миещ разтвор. 2.7. Върху допълнителните плаки се диспенсират по 12 ml ELISA буфер в А1 и В1 и по 45 ml от същия буфер в останалите ямки. 2.8. В А1 и В1 се диспенсира по 30 ml от референтен серум 1, в С1 и 1 - също, в Е1 и F1 - 30 ml от референтен серум 2, и в G1, Н1 - по 30 ml от референтен серум 3. 2.9. В ямки от А12 до Н12 се диспенсира по 30 ml от 88 изследвани серума. 2.10. В ямки от С1 до Н12 се диспенсира по 75 ml от работния разтвор на антигена, плаката се затваря, разклаща се леко и се инкубира за 30 min при 37 °С. 2.11. След приключване на инкубацията се отварят покритите с антитела ELISA плаки, диспенсират се по 50 ml работен разтвор на конюгата във всички ямки и с помощта на 12-канална пипета се прехвърлят във всички ямки по 50 ml от обема на всички ямки в допълнителните плаки. 2.12. Плаките се покриват, леко се разклащат и се инкубират за 1 h при 37 °С. 2.13. ELISA плаките се мият 6 пъти с разчет 200 - 300 ml миещ разтвор на ямка. След всеки цикъл плаките внимателно се затварят. 2.14. Във всяка ямка се диспенсира по 100 ml разтвор на хромоген/субстрат и се инкубира за 30 min при стайна температура. 2.15. Реакцията се спира чрез добавяне на 100 ml стопразтвор във всяка ямка. 2.16. Реакцията се отчита не по-късно от 15 min след добавянето на стопразтвор. Измерва се оптичната плътност на всяка ямка и резултатите се калкулират по указана от производителя формула. Валидация и интерпретация на резултатите Тестът е валиден при ODmax най-малко 1.000. Стойността на blank OD450 по-малко от 0.150. Процент инхибиция на референтен серум 2 по-голяма от 50 %. Процент инхибиция на референтен серум 3 по-малка от 50 %. Като положителни (има наличие на специфични антитела срещу протеин Еrns на вируса на КЧС) се определят всички серуми със стойности на процент инхибиция, по-големи от 50 %. Като отрицателни (няма наличност на специфични антитела срещу протеин Еrns на вируса на КЧС) се определят всички серуми със стойности на процент инхибиция, по-малки от 50 %. VI. Референтни лаборатории на общността Забележка на редакцията: виж в PDF-а на броя
Част от този текст е публикувана само като изображение или приложение в „Държавен вестник“, бр. 19 от 2006 г., и не се показва тук. Отворете оригинала