към чл. 33, т. 2, буква “а” Бруцелоза A. Серумни тестове за аглутинация 1. Стандартният аглутиниращ серум съответства на стандартния серум, приготвен от Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, England. Ампулата съдържа 1000 IU от аглутинация, получена чрез лиофилизиране на 1 ml говежди серум. 2. Стандартният серум се доставя от Bundesgesundheitsamt, Berlin. 3. Степента на бруцелозна аглутинация в серум се изразява в международни аглутиниращи единици за един милилитър (т.e. серум X = 80 IU/ml). 4. Бавната серумна аглутинация в епруветки се отчита при 50 или 75 % аглутинация, като използваният антиген е бил титриран при същите условия, както стандартния серум. 5. Аглутиниращите стойности на различните антигени по отношение на стандартния серум трябва да бъдат в следните граници: - ако отчитането е правено при 50 %: между 1/ 600 и 1/1000; - ако отчитането е правено при 75 %: между 1/ 500 и 1/750. 6. Weybridge щам № 99 и USDA 1119 или всеки друг щам с еквивалентна чувствителност се използва за приготвяне на антигена за употреба в епруветкова аглутинация (бавен метод). 7. Използваната култивационна среда за запазване на щама в лабораторията и за произвеждане на антигена трябва да бъде такава, че да не съдейства за бактериалното разпадане (S - R); предпочита се използването на картофен агар. 8. Бактериалната емулсия се изготвя от физиологичен разтвор NaCl 0,85 % фенолизирана при 0,5 %. Формол не се използва. 9. За официалното тестване на антигени отговарят следните официални институти: a) Германия: Bundesgesundheitsamt, Berlin; б) Белгия: Institut national de recherches veterinaires, Brussels; в) Франция: Laboratoire central de recherches vétérinaires, Alfort; г) Великото херцогство Люксембург: институт на доставящата държава; д) Италия: Istituto superiore di sanità, Rome; е) Нидерландия: Instituut voor Dierhonderij en Diergezondheid (ID-DLO), Lelystad; ж) Дания: Statens Veterinaere Sеrumlaboratorium, Copenhagen V; з) Ирландия: Veterinary Research Laboratory, Department of Agriculture and Food, Dublin; и) Обединено кралство: - Великобритания: Veterinary Laboratory Agency, Addlestone, Weybridge, England, - Северна Ирландия: Veterinary Research Laboratory, Stormont, Belfast; й) Гърция: Забележка на редакцията: виж в PDF-а на броя; к) Испания: Centro Nacional de Brucelosis; Laboratorio de Sanidad y Produccion Animal de Santa Fé (Granada); л) Португалия: Laboratoria Nacional de Investigaçao Veterinària, Lisbon; м) Австрия: Bundesanstalt fur Tierseuchenbekämpfung, Módling; н) Финландия: Eläinlääkintä-ja elintarvikelaitos, Helsinki-anstalten för veterinärmedicin och livsmedel, Helsingfors; о) Швеция: Statens veterinärmedicinska anstalt, Uppsala. 10. Антигени могат да бъдат доставяни в концентрирано състояние, при условие че факторът на разреждане, който ще бъде използван, е посочен на етикета на епруветката. 11. За да се извърши един серумен тест за аглутинация, се приготвят за всеки серум най-малко три разреждания. Разрежданията на съмнителен серум се правят по такъв начин, че реакцията в границата на заразяване да се отчита в средната епруветка. Ако има положителна реакция в тази епруветка, съмнителният серум съдържа най-малко 30 международни единици на аглутинация на един милилитър. Б. Реакция за свързване на комплемента 1. Стандартният серум е като по т. A.1 от приложението. В допълнение към неговото съдържание в международни аглутиниращи единици 1 ml от въпросния лиофилизиран говежди серум трябва да съдържа 1000 чувствителни единици, които свързват комплемента. Тези чувствителни единици са EИО чувствителни единици. 2. Стандартният серум се доставя от Bundesgesundheitsamt, Berlin. 3. Равнището на антитела в серума, който свързва комплемента, трябва да бъде изразено в EИО чувствителни единици (например: серум X = 60 EИО чувствителни единици на милилитър). 4. Серум, съдържащ 20 или повече EИО чувствителни единици (т.е. активност, равна на 20 % от тази на стандартния серум) на милилитър, се счита за положителен. 5. Серумите трябва да бъдат дезактивирани, както следва: a) говежди серум: 56 до 60 °C за 30 до 50 min; в) свински серум: 60 °C за 30 до 50 min. 6. За приготвянето на антигена се използва Weybridge щам № 99 или USDA щам 1119. Антигенът представлява бактериална суспензия във физиологичен серум при 0,85 % или в разтвор с концентрация на веронал. 7. За да се изпълни тестът за реакцията, следва да се използва допълнителна доза, по-висока от минималната, необходима за цялостна хемолиза. 8. При изпълнението на тест за реакция за свързване на комплемента всеки път се правят следните проверки: a) контрол на антикомплементния ефект на серума; б) контрол на антигена; в) контрол на чувствителни червени кръвни телца; г) контрол на комплемента; д) контрол чрез използване на положителен серум за чувствителност при започването на реакцията; е) контрол на специфичността на реакцията чрез използване на отрицателен серум. 9. Надзорът и официалният контрол на стандартни серуми и антигени се извършват от органите, посочени в раздел A, т. 9 на приложението. 10. Антигените могат да бъдат доставяни в концентрирано състояние, при условие че факторът на разреждане, който ще бъде използван, е посочен на етикета на епруветката. В. Ринг тест 1. Ринг тестът се провежда върху съдържанието на всеки бидон мляко или върху съдържанието на всяка цистерна за мляко от фермата. 2. Стандартният антиген, който се използва, трябва да произхожда от един от институтите, изброени в раздел A, т. 9, буква a - й. Препоръчва се антигените да бъдат стандартизирани съгласно препоръките на СЗО/ФАО. 3. Антигенът може да бъде от щам само с хематоксилин или тетразолиум; предпочита се използването на хематоксилин. 4. Ако не е използвано консервиране, тестът за реакция се извършва между 18 и 24 h от взимането на пробата от кравата. Ако млякото се тества по-късно от 24 h след взимане на пробата, тогава се използва консервация; формалин или живачен хлорид могат да бъдат използвани като консерванти и ако се използва едно от двете, тестът се извършва в рамките на 14 дни от деня на вземане на пробата. Формалин може да бъде добавен, за да даде финална концентрация в млечната проба 0,2 % и в такъв случай съотношението между количеството мляко и разтвора на формалин е най-малко 10 към 1. Разтвор от живачен хлорид може да бъде използван вместо формалин, за да даде финална концентрация в млякото 0,2 % и в такъв случай съотношението между количеството мляко и разтвора на живачен хлорид трябва да е 10 към 1. 5. Тестът се изпълнява, като се използва един от следните методи: - върху колона от мляко най-малко 25 mm висока и върху обем от мляко 1 ml, към което е било добавено 0,03 ml от един от стандартизираните щамови антигени, - върху колона от мляко най-малко 25 mm висока и върху обем от мляко 1 ml, към което е добавено 0,05 ml от един от стандартизираните щамови антигени, - върху обем от мляко 8 ml, към което е добавено 0,08 ml от един от стандартизираните щамови антигени, - върху колона от мляко най-малко 25 mm висока и върху обем от мляко 2 ml, към което е добавено 0,05 ml от един от стандартизираните щамови антигени. 6. Сместа от мляко и антигени се инкубира при 37 °C за не по-малко от 45 min и не повече от 60 min. Тестът се отчита в рамките на 15 min от изваждането от инкубатора. 7. Реакцията се отчита съгласно следните критерии: a) отрицателна реакция: оцветено мляко, безцветна сметана; б) положителна реакция: идентично оцветени мляко и сметана или безцветно мляко и оцветена сметана. Г. Тест с буфериран бруцелозен антиген Буферираният бруцелозен антиген тест може да бъде изпълнен по един от следните методи: a) Ръчен тест 1. Стандартният серум е вторият международен стандартен серум анти-brucella abortus, който се доставя от Ветеринарната лабораторна агенция, Addlestone, Weybridge, Англия. 2. Антигенът се приготвя, без да се посочва клетъчната концентрация, но неговата чувствителност се стандартизира по отношение на втория международен стандартен анти-brucella abortus серум по такъв начин, че антигенът да произведе положителна реакция при разреждане на серума 1:47,5 и отрицателна реакция с разреждане 1:55. 3. Антигенът се суспензира в буфериран бруцелозен антиген разредител при pH от 3,65 ± 0,5 и може да бъде извлечен щам чрез употребата на розов бенгалски оцветител. 4. За приготвяне на антигена се използва Weybridge щам № 99 или USDA 1119 или всеки щам с еквивалентна чувствителност. 5. За запазване на щама в лабораторията и за произвеждане на антигена се използва култивираща среда, която не стимулира бактериалното разпадане (S - R); би следвало да бъде използвана картофена агар среда или методи на постоянно култивиране. 6. Антигенът се тества срещу осем известни положителни и отрицателни серуми в замразено и сушено състояние. 7. Официалният надзор и контрол на стандартния серум и антиген се изпълнява от официалните органи, изброени в раздел A, т. 9 от приложението. 8. Антигенът се доставя готов за използване. 9. Буферираният бруцелозен антиген тест се изпълнява по следния начин: a) една капка (0,03 ml) от антиген се поставя до една капка (0,03 ml) от серума върху бяла пластина; б) двете капки се смесват с апликаторна бъркалка, първо в права линия и след това в кръгова с диаметър 10 до 12 mm; в) след това пластината се разклаща напред и назад за 4 min (около 30 пъти на минута); г) отчитанията се извършват при добра светлина; ако няма доказателство за аглутинация, тестът се счита за отрицателен; всяка степен на аглутинация се счита за положителна, освен ако там има прекомерно изсушаване около краищата. б) Автоматизиран метод Автоматизираният метод трябва да бъде най-малко толкова чувствителен и прецизен, колкото е ръчният метод. Д. Плазмен ринг тест a) Екстракция на плазмата Епруветката, съдържаща кръв, чието съсирване е било спряно от добавянето на EDTA, се центрофугира за 3 min при 3000 оборота/мин и след това се държи при 37 °C за 12 до 24 h. б) Отчитане 0,2 ml от стабилизираната плазма се поставя в епруветка с 1 ml необработено мляко. След смесване една капка (0,05 ml) от ABR антиген се добавя и цялото се смесва отново. Използва се стандартен антиген, доставен от орган по раздел A, т. 9 a). След инкубационен период 45 min при 37 °C се прави отчитане в рамките на 15 min. Резултатът се разглежда като положителен, ако цветът на ринга е станал също като или по-тъмен от този на млечната колона. Е. Плазмена аглутинация Плазмата, извлечена в съответствие с раздел Д, буква “a”, може да бъде използвана незабавно след центрофугиране, без да е нужно термично стабилизиране. 0,05 ml плазма се смесват с 1 ml антиген за 50 % серумна аглутинация, която съответства на разреждане 1:20 за серумна аглутинация. Отчитането се извършва след 18 до 24 h инкубиране при 37 °C. Като положителна се приема 50 % или повече аглутинация. Ж. Тест за микроаглутинация 1. Разредители се изготвят от 0,85 % физиологичен разтвор, фенолизиран при 0,5 %. 2. Антигенът се приготвя, както е описано в раздел A, т. 6, 7 и 8, и се титрира, както е описано в раздел A, т. 5. При използване на антиген се добавя сафран O при 0,02 % (финално разреждане). 3. Стандартният серум е като по A.1. 4. Стандартният серум се доставя от Bundesgesundheitsamt, Berlin. 5. Тестът за микроаглутинация се провежда в корита с клетки с конусовидни дъна с обем 0,250 ml, както следва: a) предварително разреждане на серума: 0,050 ml от всеки серум, който ще се тества, се добавят към всяка клетка, съдържаща 0,075 ml разредител; смесите се разклащат за 30 s; б) постепенно серумно разреждане: приготвят се най-малко три разреждания за всеки серум, за целта предварително разредените (1:2,5) 0,025 ml от всеки серум се взима и прехвърля към клетка, съдържаща 0,025 ml разредител; по този начин първото разреждане достига сила 1:5 и следващите разреждания се изпълняват чрез дублиране; в) добавяне на антиген: 0,025 ml антиген се добавя към всяка клетка, съдържаща различните серумни разреждания, след като бъдат разклащани за 30 s, коритата се затварят със съответните им капаци и се държат при 37 °C за 20 до 24 h във влажна атмосфера; г) отчитане на резултатите: видът на седиментация на антигена се оценява чрез изследване на дъното на клетката, отразено във вдлъбнато огледало, поставено върху нея; ако има негативна реакция, антигенът формира седимент във формата на компактна пъпка с чисти краища и с наситен червен цвят; ако има положителна реакция от друга страна, се формира равномерно разположено разпръснато розово покривало. Различните проценти на аглутинация се определят чрез сравнение с антигенни проверки, показващи 0, 25, 50, 75 и 100 % аглутинация; заглавието на всеки серум се изразява в международни единици на аглутинация на милилитър; тестът включва проверки с отрицателен и положителен серум, разредени така, че да съдържат 30 международни аглутиниращи единици на един ml. З. Имуноензимен метод (ЕЛАЙЗА) за откриване бруцелоза по говедата 1. Материалите и реагентите, които се използват, са както следва: a) твърда фаза - микроплаки, епруветки и друга твърда фаза; б) антиген, фиксиран към твърдата фаза със или без помощ на поликлонални или моноклонални улавящи антитела; в) тествана биологична течност; г) субстрат, адаптиран към използвания ензим; д) спиращ разтвор, ако е необходимо; е) разтвори за разреждането на тестовите проби за приготвяне на реагенти и за измиване; ж) отчитаща система, подходяща за използвания субстрат. 2. Стандартизация и чувствителност на тест
(1) Насипните млечни проби се класифицират като отрицателни, ако дават реакция, по-малка от 50 % от онази, дадена от 1 в 10 000 разреждане на втория международен бруцелозен стандартен серум, изпълнен в “отрицателно” мляко.
(2) Индивидуалните серум проби се класифицират отрицателни, ако дават реакция, по-малка от 10 % на тази, дадена от 1 в 200 разреждане на втория международен бруцелозен стандартен серум, направен във физиологичен разтвор или друг признат разтвор, в съответствие с процедурата по чл. 17 след получаване на становището на научния ветеринарен комитет. Бруцелозните ЕЛАЙЗА стандарти са, както са уточнени в раздел A, т. 1 и 2 (използват се при разреждането, посочено върху етикета). 3. Условия за използване на ЕЛАЙЗА теста за бруцелоза по говедата Методът ЕЛАЙЗА може да бъде използван при проба от мляко или суроватка, взета от събраното от ферма мляко с най-малко 30 % млечни крави в процес на лактация. Ако този метод е използван, се вземат мерки, за да се гарантира, че взетите проби могат да бъдат идентифицирани с животните, от които е било взето млякото или серумите.
Част от този текст е публикувана само като изображение или приложение в „Държавен вестник“, бр. 48 от 2006 г., и не се показва тук. Отворете оригинала